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Aug 09, 2023

Cholinergisch

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12833 (2023) Diesen Artikel zitieren Metrikdetails Die familiäre Alzheimer-Krankheit (FAD) ist eine komplexe neurodegenerative Erkrankung, für die es keine gibt

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12833 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die familiäre Alzheimer-Krankheit (FAD) ist eine komplexe neurodegenerative Erkrankung, für die es bisher keine Therapie gibt. Mehrere Mutationen in Presenilin 1 (PSEN 1), der katalytischen Komponente des γ-Sekretase-Komplexes, sind ursächlich für FAD. Kürzlich wurde in Kolumbien über die p.Ile416Thr (I416T) PSEN 1-Mutation in großer Zahl berichtet. Zell- und molekulare Informationen zur I416T-Mutation sind jedoch rar. Hier zeigen wir, dass von Menstruationsstromazellen (MenSCs) abgeleitete planare (2D) cholinerge PSEN 1 I416T-Zellen (ChLNS) und (3D) zerebrale Sphäroide (CSs) die typischen neuropathologischen Marker von FAD in 4 oder 11 Fällen nach der Transdifferenzierung reproduzieren Tage der Transdifferenzierung bzw. Die Modelle erzeugen eine intrazelluläre Aggregation von APPβ-Fragmenten (am Tag 4 und 11) und phosphoryliertem Protein TAU am Rest Ser202/Thr205 (am Tag 11), was darauf hindeutet, dass iAPPβ-Fragmente p-TAU vorausgehen. Mutierte ChLNs und CSs zeigten DJ-1 Cys106-SO3 (Sulfonsäure), Versagen des Mitochondrienmembranpotentials (ΔΨm) und Aktivierung der Transkriptionsfaktoren c-JUN und p53, Expression des proapoptotischen Proteins PUMA und Aktivierung des Executor-Proteins Caspase 3 (CASP3), alles Marker für Zelltod durch Apoptose. Darüber hinaus stellten wir fest, dass sowohl mutierte ChLNs als auch CSs große Mengen an extrazellulärem eAβ42 produzierten. Die I416T-ChLNs und -CSs reagierten im Vergleich zu WT nicht auf den durch Acetylcholin induzierten Ca2+-Einstrom. Die I416T-PSEN-1-Mutation könnte als dominant-negative PSEN1-Mutation wirken. Diese Ergebnisse könnten zum Verständnis der wiederkehrenden Misserfolge klinischer Studien mit Anti-eAβ42 beitragen und die Ansicht stützen, dass FAD durch die Akkumulation anderer intrazellulärer AβPP-Metaboliten und nicht durch eAβ42 ausgelöst wird.

Presenilin 1 (PSEN1) ist eine intramembranäre Aspartylprotease1, die den Kern des γ-Sekretasekomplexes darstellt, der für die Amyloid-β (Aβ)-Erzeugung verantwortlich ist2,3. Fünf PSEN1-Mutationen (z. B. p.Met146Leu, p.His163Arg, p.Ala246Glu, p.Leu286val, p.Cys410Tyr) wurden ursprünglich 1995 auf dem menschlichen Chromosom 14 (14q24.3) durch genetische Analyse von sechs großen Stammbäumen mit Alzheimer-Krankheit entdeckt (AD)4. Seitdem wurden mehr als 300 Mutationen in PSEN1 gemeldet (https://www.alzforum.org/mutations/psen-1) und stehen im Zusammenhang mit der häufigsten Ursache der früh einsetzenden familiären Alzheimer-Krankheit (FAD)5. Unter diesen Varianten wurde die Missense-Mutation p.Glu280Ala (p.E280A) in großen kolumbianischen Verwandten entdeckt6. Die PSEN1 p.E280A-Mutation europäischer Abstammung7, auch bekannt als Paisa-Mutation8, betrifft fast 1.000 Personen mit etwa 400 bestätigten Trägern. Da die kolumbianische Verwandtschaft eine engagierte Teilnahme und Einhaltung in Längsschnittstudien gezeigt hat, wurden die Auswirkungen dieser Mutation nicht nur im Zusammenhang mit genetischen9,10, zellulären11,12,13, neuropathologischen14,15, neuropsychologischen16,17 und neurologischen Analysen18 ausführlich untersucht. 19,20,21, aber auch in der Biomarker-Progression22,23,24,25 und in klinischen Präventionsstudien (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01998841;26). Interessanterweise wurde die klassische Pathogenese der PSEN1-E280A-Mutation in von Fibroblasten abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs)11, in von Warthon Jelly MSCs abgeleiteten cholinergen neuronalen Zellen (ChLNs)27 und in von Menstruations-MSCs abgeleiteten zerebralen Zellen modelliert Sphäroide (CSs)28. Insbesondere zeigten die PSEN1 p.E280A ChLN-Zellen und CSs eine erhöhte Sekretion von extrazellulärem Aβ, hauptsächlich eAβ42-Peptidfragment, intrazelluläre Aggregation von Beta-Fragmenten des löslichen Amyloid-Vorläuferproteins (iAPPβf) und oxidativen Stress (OS, d. h. Oxidation des Stresssensorproteins). DJ-1 Cys106SO− in Cys106SO3), Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm), Hyperphosphorylierung des Proteins Tau (am Rest Ser202/Thr205), Dysregulation des intrazellulären Ca2+-Einstroms und Apoptose27,28. Obwohl der genaue Mechanismus, durch den PSEN1-Mutationen (/γ-Sekretase) große Mengen des extrazellulären amyloidogenen Aβ42-Fragments erzeugen, noch nicht gut geklärt ist29,30,31, fungiert PSEN1 p.E280A dabei als dominant-negative PSEN1-Mutation32,33 Auslösen intrazellulärer und extrazellulärer Aβ-abhängiger Signale, die zum neuronalen Tod führen.

Leider wurden in Kolumbien zusätzlich zur PSEN1 p.E280A-Mutation zehn weitere PSEN1-Mutationen europäischer (fünf), indianischer (drei), unbestimmter (1) und afrikanischer (eine) Abstammung gemeldet34. Insbesondere wurde in der Region Antioquia über eine neuartige, pathogene Missense-Variante afrikanischer Abstammung PSEN1 Ile416Thr (Chr14:73683951T > C; c.1247T > C; p.I416T) berichtet, die bei vielen Verwandten AD verursacht35 (für eine journalistische Version siehe36). Bemerkenswerterweise ähnelten das zerebrale Muster der Aβ-Ablagerung und die PET-Tau-Scans bei I416T-Trägern denen, die zuvor bei PSEN1 p.E280A-Trägern berichtet wurden37,38. Ebenso ergab die neuropsychologische Untersuchung symptomatischer Träger ein mittleres Erkrankungsalter von 42,35 ± 6,28 Jahren bei Gedächtnisbeschwerden, 47,6 ± 5,83 Jahren bei leichter kognitiver Beeinträchtigung (MCI) und das mittlere Erkrankungsalter bei Demenz betrug 51,6 ± 5,03 Jahre Depressionen, Angstzustände, Wahnvorstellungen, Halluzinationen und Schlaflosigkeitsanalysen ähnelten ebenfalls denen, die für die E280A-Mutation berichtet wurden8,39. Diese Beobachtungen legen nahe, dass sowohl I416T als auch E280A unabhängig von der Herkunft ihrer Abstammung genetisch und phänotypisch homologe Varianten sind. Ob die I416T-Variante zelluläre und/oder molekulare Marker ähnlich wie E280A exprimiert, ist jedoch noch unbekannt. Die Beantwortung dieser Frage ist keine leichte Aufgabe, da diese Informationen dazu dienen könnten, zu beantworten, ob potenzielle Behandlungsentwicklungen und/oder klinische Präventionsstudien, die bei E280A entdeckt wurden, auch für I416T-Patienten gelten könnten. Darüber hinaus ist es abhängig von den von den verschiedenen PSEN1-Varianten generierten Aβ-Profilen möglich, die Pathogenität einer bestimmten Mutation zu bestimmen und das Alter bei Krankheitsausbruch vorherzusagen40. Basierend auf den obigen Überlegungen und der Tatsache, dass beide Mutationen zu 100 % penetrant sind8,35, gehen wir davon aus, dass sich I416T in Zellmodellen von FAD molekular wie die E280A-Paisa-Mutation verhält.

Endometriale mesenchymale Stammzellen (enMSCs) sind eine Klasse adulter Stammzellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit, Differenzierungspotenzial, geringer Immunogenität, geringer Tumorigenität und anderen biologischen Eigenschaften41,42. Spezifische Oberflächenmarker (z. B. CD140b/CD146-Koexpression, SUSD2) haben ihre perivaskuläre Identität im Endometrium gezeigt, einschließlich der Schicht, die sich während der Menstruation ablöst. Zellen mit MSC-Eigenschaften wurden in der Menstruationsflüssigkeit identifiziert und allgemein als Menstruationsblutstamm-/Stromazellen (MenSC) bezeichnet43. Kürzlich haben wir MenSCs als zuverlässige Quelle für planare (2D) ChLNs und zerebrale Sphäroide (3D CSs) oder Neurosphären validiert44. Da das Protokoll zur Gewinnung mutierter hiPSCs nicht weniger als 35 Tage45,46 dauert, haben wir PSEN1 I416T MenSCs als experimentelle biologische Quelle ausgewählt, die nur minimale technische Einschränkungen und kleinere ethische Probleme aufweist. Darüber hinaus zeigen von MenSCs abgeleitete ChLNs und CSs die neuropathologischen AD-Merkmale bis zum Tag 1127,28. In der vorliegenden Arbeit wollten wir ein in vitro von MenSCs abgeleitetes neuronalähnliches Modell etablieren, das die Mutation I416T trägt. Wie bei E280A fanden wir heraus, dass die PSEN1 I416T-Mutation die Struktur und Funktionalität von MenSCs-abgeleiteten planaren (2D) ChLNs und 3D-CSs, die hohe iAPPβf-Aggregate und große Mengen an eAβ42 sowie hyperphosphoryliertes Protein Tau exprimieren, negativ beeinflusst. Darüber hinaus zeigte PSEN1 I416T auch einen Verlust von ΔΨm, eine hohe Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS, d. h. H2O2), Anzeichen von Apoptosetod und Veränderungen im Ca2+-Einstrom (Tabelle 1). Daher gehen wir davon aus, dass experimentelle Behandlungsansätze für FAD E280A47 auch für FAD I416T gültig sein könnten.

Wir haben zunächst den genetischen Presenilin-Genstatus der MenSC-Spender überprüft. Wie in Abb. 1A gezeigt, zeigt die Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP-VspI (AseI)) eines positiven (Kontroll-)Heterozygoten für die Mutation PSEN1 I416T drei Fragmente mit 560, 340 und 220 bp (Spur Nr. 1). WT PSEN1 produziert zwei Fragmente von nur 340 und 220 bp (Spur Nr. 2). Die Änderung eines T>C im Codon 416 (d. h. ATT zu ACT) erzeugt einen zweiten Schnitt im Exon 11 von PSEN1, der vom Restriktionsenzym VspI (AseI) erkannt wird. Basierend auf dieser Beobachtung haben wir bestätigt, dass die MenSCs-Probe (TBC# 45000) die PSEN1 I416T-Mutation aufweist (Spur Nr. 3). Wir bestätigen außerdem, dass die DNA-Probe eines Mutationsträgers E280A (TBC#271) negativ für PSEN1 I416T (Spur Nr. 4) war. Als Qualitätskontrolle inkubierten wir ein DNA-Aliquot mit der PSEN1 I416T-Mutation (TBC# 45000) ohne RE VspI (AseI) (Spur Nr. 5, 540-bp-Band) oder ohne DNA-Vorlagen (oder Primer, Spur Nr. 6, Nr Bands).

(A) Agarosegelelektrophorese für die I416T-Mutation, isoliert aus Proben von Mutationsträgern. PCR-Produkte aus Blutproben wurden einer Restriktionsendonuklease-Verdauungsanalyse unter Verwendung des AseI-Enzyms unterzogen, auf einer 2 %igen Agarosegelelektrophorese aufgelöst und mit rotem Gel unter ultravioletter Beleuchtung sichtbar gemacht. Die Größe des Amplikons betrug 560 bp. Die 340- und 220-bp-Fragmente entsprechen dem Wildtyp-Phänotyp, und die 560-, 340- und 220-bp-Fragmente entsprechen dem mutierten heterozygoten Phänotyp. (M) Molekulargewichtsmarker; Spur (1) Positivkontrolle mit der I416T-Mutation (Code 2495); Spur (2) Wildphänotyp-Negativkontrolle (Code 69.308); Spur (3) Mutationsträger (Code 45.000); Spur (4) Mutationsträger E280A (Code 271); Spur (5) Kontrolle der Verdauung (Code 4500, ohne das AseI-Enzym); Spur (6) PCR-Kontrolle (ohne Vorlage). Das Originalgel ist in der ergänzenden Abbildung dargestellt. 1. (B, D) Osteocalcin färbte undifferenzierte MenSCs, die auf normalem Kulturmedium gezüchtet wurden, negativ. (C, E) Osteocalcin positiv gefärbte Osteoblasten, die sich von MenSCs unterschieden. (F, H) FABP4 färbte undifferenzierte MenSCs, die auf normalem Kulturmedium gezüchtet wurden, negativ. (G, I) FABP4-positiv gefärbte Adipozyten, die sich von MenSCs unterscheiden. (J, L) Aggrecan färbte undifferenzierte MenSCs, die auf normalem Kulturmedium gezüchtet wurden, negativ. (K, M) Aggrecan-positiv gefärbte Chondrozyten, differenziert von MenSCs. Bildvergrößerung, 20x. Die Bilder stellen eines von drei unabhängigen Experimenten dar. (N–Q) MenSCs transdifferenzierten sich in cholinerge-ähnliche Neuronen. WT PSEN1- und PSEN1 I416T-MenSCs wurden 7 Tage lang in einem cholinergen Differenzierungsmedium kultiviert, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. Danach wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. Anschließend wurden die Zellen mit Primärantikörpern gegen ChAT (rote Fluoreszenz; N'–Q') und VAChT (grüne Fluoreszenz; N''–Q'') doppelt gefärbt. Die Kerne werden mit Hoechst 33.342 (blaue Fluoreszenz; N'''–Q''') gefärbt. (R) Quantifizierung der ChAT-Fluoreszenzintensität. (S) Quantifizierung der VAChT-Fluoreszenzintensität. Die Abbildungen repräsentieren 1 von 3 unabhängigen Experimenten. Einfaktorielle ANOVA, Post-hoc-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001) dargestellt.

Da sich die MenSCs in mesodermale und ektodermale Zelllinien differenzieren können, inkubierten wir WT- und PSEN1 I416T-MenSCs mit ihrem jeweiligen adipogenen, osteogenen, chondrogenen und cholinergen Medium gemäß Standardprotokollen44. Wie erwartet wurden weder in WT- noch in mutierten MSCs Differenzierungsmarker angezeigt, wenn sie in normalem Kulturmedium kultiviert wurden (RCm, Abb. 1B, D, F, H, J, L), wohingegen WT- und mutierte MenSCs in beide Osteozyten differenzierten (Abb. 1C,E), Adipozyten- (Abb. 1G, I) oder Chondrozytenzellen (Abb. 1K, M) gemäß Osteocalcin, Fettsäurebindungsprotein 4 (FABP4) bzw. Aggrecan-positiven Zellen. Darüber hinaus konnten MenSCs gemäß den cholinergen Markern ChAT (Abb. 1R) und VAChT (Abb. 1S) auch in cholinerge-ähnliche neuronale Zellen (ChLNs, Abb. 1N – Q) transdifferenzieren.

Als nächstes wollten wir feststellen, ob mutierte neuronale Zellen neuropathologische Marker für AD exprimieren. Zu diesem Zweck kultivierten wir ChLN-Zellen 0 und 4 Tage nach der Transdifferenzierung in RCm. Anschließend wurden Amyloid-, Mitochondrien- und OS-Marker bewertet. Wie in Abb. 2 gezeigt, wurde am Tag 0 weder iAPPβf (Abb. 2A', B') noch oxidiertes DJ-1-Protein (Abb. 2A'', B'') in WT-ChLNs nachgewiesen (Abb. 2A, E). und 4 (Abb. 2B,F). Im Gegensatz dazu zeigen I416T-ChLNs sAPPβf-Aggregate (Abb. 2C', D', E) und oxDJ-1 (Abb. 2C'', D'', F) am Tag 0 und 4 nach der Transdifferenzierung (Abb. 2E, F). ). Tatsächlich verdoppelt sich die Menge an iAPPβf und oxDJ-1 am Tag 4 nach der Transdifferenzierung fast. Die Durchflusszytometrieanalyse am Tag 4 (Abb. 2G–J) zeigte, dass die Menge an sAPPβf und oxDJ-1 im Vergleich zu um +600 % (Abb. 2G,H) bzw. +384 % (Abb. 2I,J) anstieg WT ChLNs. Als die Erzeugung von ROS und ΔΨm in diesen Zellen ausgewertet wurde, fanden wir hohe ΔΨm (Abb. 3A‘, B‘), aber keine ROS (Abb. 3A‘‘, B‘‘) in WT-ChLNs am Tag 0 und 4 (Abb . 3A,B,E,F) gemäß immunzytochemischer Analyse. Die mutierten ChLNs (Abb. 3C, D) zeigen eine signifikante Verringerung von ΔΨm am Tag 0 (1,41-fache Abnahme, Abb. 3C', E) und am Tag 4 (1,10-fd, Abb. 3D', E), aber ein signifikanter Anstieg der ROS-Erzeugung (2,25-facher Anstieg und 3,0-fach, Abb. 3C'',D'',F). Ein ähnlicher Beobachtungstrend wurde durch Durchflusszytometrie am 4. Tag ermittelt (Abb. 3G – J). Tatsächlich verringerte sich ΔΨm in mutierten Zellen um -86 % (Abb. 3G, H), während die ROS-Produktion im Vergleich zu WT PSEN 1 um +1067 % anstieg (Abb. 3I, J).

PSEN1 I416T Cholinergic-Like Neurons (ChLNs) weisen hohe Mengen an intrazellulärem sAPPβf und oxidiertem DJ-1 auf. WT PSEN1- und PSEN1 I416T-MenSCs wurden 7 Tage lang in einem cholinergen Differenzierungsmedium kultiviert, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. Danach wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. (A–D) Die Zellen wurden doppelt mit Primärantikörpern gegen APP751/Aβ42 (rote Fluoreszenz; A'–D') und oxDJ-1Cys106 (grüne Fluoreszenz; A“–D“) gefärbt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33.342 (blaue Fluoreszenz; A''–D'') angefärbt. (E) Quantifizierung von sAPPβf durch Fluoreszenzintensität. (F) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von oxDJ-1Cys106 (n = 3). (G) Quantifizierung von sAPPβf mittels Durchflusszytometrie. (H) Quantifizierung von sAPPβf mittels Durchflusszytometrie (n = 3). (I) Quantifizierung von oxDJ-1 mittels Durchflusszytometrie. (J) Quantifizierung von oxDJ-1 mittels Durchflusszytometrie (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Die Histogramme und Abbildungen repräsentieren eines von drei unabhängigen Experimenten. Bildvergrößerung, 200x.

PSEN1 I416T Cholinergic-Like Neurons (ChLNs) weisen ein hohes mitochondriales Membranpotential (ΔΨm) und hohe Mengen an intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auf. WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-MenSCs wurden in einem cholinergen Differenzierungsmedium wie im Abschnitt „Experimentelle Vorgehensweise“ beschrieben 7 Tage lang kultiviert. Danach wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. (A–D) Die Zellen wurden doppelt mit MitoTracker™ Red FM (rote Fluoreszenz; A'–D') und DCF (grüne Fluoreszenz; A“–D“) gefärbt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33.342 (blaue Fluoreszenz; A''–D'') angefärbt. (E) Quantifizierung von ΔΨm durch Fluoreszenzintensität. (F) Quantifizierung der DCF-Fluoreszenzintensität (n = 3). (G) Repräsentatives Histogramm, das ΔΨm durch Durchflusszytometrie zeigt. (H) Quantifizierung von ΔΨm mittels Durchflusszytometrie (n = 3). (I) Repräsentatives Histogramm, das DCF + durch Durchflusszytometrie zeigt. (J) Quantifizierung von DCF mittels Durchflusszytometrie (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Die Histogramme und Abbildungen repräsentieren eines von drei unabhängigen Experimenten. Bildvergrößerung, 200x.

Es ist bekannt, dass ROS/H2O2 c-JUN, P53, proapoptotisches PUMA und CASPASE-348 aktivieren. Wenig überraschend zeigte die immunzytochemische Analyse, dass WT-ChLNs am Tag 0 weder aktiviertes c-JUN (Abb. 4A', B') noch CASP-3 (Abb. 4A'', B'') aufweisen (Abb. 4A, E, F). ) und 4 (Abb. 4B,E,F). Im Gegenteil, wir haben aktiviertes c-JUN (Abb. 4C' und 4D') und CASP3 (Abb. 4C'', D'') am Tag 0 (11,0-fi: 4E und 9,36-fi: 4F) nachgewiesen. bzw. am Tag 4 (Abb. 4D, 17,42-fi: 4E, 4,20-fi: 4F) in I416T-ChLNs. Die Auswertung der Durchflusszytometrie ergab eine ähnliche Tendenz der Daten am Tag 4 (Abb. 4G – J). Bemerkenswert ist, dass c-JUN (Abb. 4G, H) und CASP3 (Abb. 4I, J) ihre Expression in PSEN 1 I416T-ChLNs im Vergleich zu WT-ChLNs um +780 % bzw. +620 % erhöhten.

PSEN1 I416T ChLNs zeigen die Aktivierung c-JUN und CASPASE-3 an. WT PSEN1- und PSEN1 I416T-MenSCs wurden 7 Tage lang in einem cholinergen Differenzierungsmedium kultiviert, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. Danach wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. (A–D) Die Zellen wurden doppelt mit c-JUN (rote Fluoreszenz; A'–D') und CASPASE-3 (grüne Fluoreszenz; A“–D“) gefärbt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33.342 (blaue Fluoreszenz; A''–D'') angefärbt. (E) Quantifizierung von c-JUN durch Fluoreszenzintensität. (F) Quantifizierung der CASPASE-3-Fluoreszenzintensität (n = 3). (G) Quantifizierung von c-JUN mittels Durchflusszytometrie. (H) Quantifizierung von c-JUN mittels Durchflusszytometrie (n = 3). (I) Quantifizierung von CASPASE-3 mittels Durchflusszytometrie. (J) Quantifizierung von CASPASE-3 mittels Durchflusszytometrie (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Die Histogramme und Abbildungen repräsentieren eines von drei unabhängigen Experimenten. Bildvergrößerung, 200x.

Wie bei c-JUN/CASP3 fanden wir heraus, dass WT-ChLNs am Tag 0 weder aktiviertes PUMA (Abb. 5A', B') noch P53 (Abb. 5A'', B'') aufweisen (Abb. 5A, E, F). und 4 (Abb. 5B, E, F) gemäß immunzytochemischer Analyse. Wir entdeckten aktiviertes PUMA (Abb. 5C', D'), p53 (Abb. 5C'', D'') am Tag 0 (Abb. 5C, 3,20-fi: E bzw. 4,50-fi: F). und am Tag 4 (Abb. 5D, 5,70-fi: E bzw. 23,21-fi: F) in I416T-ChLNs. Bemerkenswert ist, dass PUMA (Abb. 5G, H) und P53 (Abb. 5I, J) ihre Expression um +940 % bzw. +400 % erhöhten, was durch Durchflusszytometrie-Bewertung am Tag 4 (Abb. 5G–J) festgestellt wurde mutierte ChLNs.

PSEN1 I416T ChLNs zeigen Aktivierung P53 und PUMA an. WT PSEN1- und PSEN1 I416T-MenSCs wurden 7 Tage lang in einem cholinergen Differenzierungsmedium kultiviert, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. Danach wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. (A–D) Die Zellen wurden doppelt mit PUMA (grüne Fluoreszenz; A’–D’) und P53 (rote Fluoreszenz; A’–D’) gefärbt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33.342 (blaue Fluoreszenz; A''–D'') angefärbt. (E) Quantifizierung von PUMA durch Fluoreszenzintensität. (F) Quantifizierung der P53-Fluoreszenzintensität (n = 3). (G) Quantifizierung von PUMA mittels Durchflusszytometrie. (H) Quantifizierung von PUMA mittels Durchflusszytometrie (n = 3). (I) Quantifizierung von P53 mittels Durchflusszytometrie. (J) Quantifizierung von P53 mittels Durchflusszytometrie (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Die Histogramme und Abbildungen repräsentieren eines von drei unabhängigen Experimenten. Bildvergrößerung, 200x.

Intrazellulär hyperphosphoryliertes Protein Tau (p-TAU Ser202/Thr205) ist ein klassischer pathologischer Marker bei AD (Neddens et al., 2020). Daher haben wir untersucht, ob mutierte ChLNs p-TAU aufweisen. Abb. 6 zeigt, dass WT-ChLNs am Tag 0 (Abb. 6A, E) und 4 (Abb. 6B, E) kein p-TAU aufwiesen. Ebenso war in I416T-ChLNs am Tag 0 kein p-TAU fast unentdeckt (Abb. 6C, E), aber das phosphorylierte Protein wurde in mutierten ChLNs am Tag 4 identifiziert (76,11-fi, Abb. 6D, E). Bemerkenswert ist, dass p-TAU laut Durchflusszytometrie-Analyse in I416T-Zellen im Vergleich zu WT-ChLNs um +520 % erhöht war (Abb. 6F, G).

PSEN1 I416T ChLNs zeigen ein hohes Maß an Phosphorylierung des Proteins TAU. WT PSEN1- und PSEN1 I416T-MenSCs wurden 7 Tage lang in einem cholinergen Differenzierungsmedium kultiviert, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. Danach wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. (A–D) Zellen wurden mit p-TAU (grüne Fluoreszenz; A'–D') gefärbt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33.342 (blaue Fluoreszenz; A“–D“) angefärbt. (E) Quantifizierung von p-TAU durch Fluoreszenzintensität. (F) Quantifizierung von p-TAU mittels Durchflusszytometrie. (G) Quantifizierung von p-TAU mittels Durchflusszytometrie (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Die Histogramme und Abbildungen repräsentieren eines von drei unabhängigen Experimenten. Bildvergrößerung, 200x.

Das Molverhältnis von Aβ42 zu Aβ40 wird häufig als Proxy-Indikator für die pathogene Wirkung von Presenilin-Mutationen verwendet. Abb. 7A zeigt, dass WT-PSEN-1-ChLNs vier Tage nach der Transdifferenzierung einen Grundspiegel an Aβ40 und Aβ42 produzierten, wohingegen PSEN-1-I416T-ChLNs einen Grundspiegel an Aβ40, aber eine hohe Menge an Aβ42 (d. h. die doppelte Menge an Aβ40) freisetzten . Daher erhöhte das mutierte PSEN 1 die Menge an Aβ42-Peptid signifikant (um +125 %) im Vergleich zu WT PSEN 1, was zu einem höheren Verhältnis von Aβ42 führte (2,42-facher Anstieg, Abb. 7B).

ELISA-Quantifizierung von extrazellulärem Aβ40- und Aβ42-Peptid in Überständen von WT-PSEN1- und I416T-ChLNs und zerebralen Sphäroiden (CSs). WT PSEN1- und PSEN1 I416T-MenSCs wurden in einem cholinergen N-Run-Differenzierungsmedium wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben 7 Tage lang kultiviert. Danach wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs nach der Transdifferenzierung 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. Die Konzentrationen der sekretierten Aβ1–42- und Aβ1–42-Peptide wurden wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben bestimmt. (A) ELISA-Messungen des Überstands von PSEN1 I416T ChLNs-Zellen am Tag 4 nach der Transdifferenzierung. (B) Verhältnis von Aβ42 zu Aβ40 in PSEN1 I416T ChLNs im Vergleich zu PSEN1 WT am Tag 4. WT PSEN1 und PSEN1 I416T MenSCs wurden in einem Fast-N-Spheres-Medium 11 Tage lang kultiviert, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. (C) ELISA-Messungen des Überstands von PSEN1 I416T CSs-Zellen am Tag 11. (D) Aβ42-zu-Aβ40-Verhältnis in PSEN1 I416T CSs im Vergleich zu PSEN1 WT am Tag 11. Die Zahlen stellen 1 von 3 unabhängigen Experimenten dar. Einfaktorielle ANOVA, Post-hoc-Test Bonferroni. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001) dargestellt.

Ein typisches Funktionsmerkmal von Neuronen ist, dass sie auf den ACh-induzierten Ca2+-Einstrom reagieren. Wir untersuchten daher, ob PSEN1 I416T ChLNs auf ACh-Stimuli reagieren. Zu diesem Zweck wurden sowohl WT- als auch mutierte PSEN1-ChLN-Kulturen ACh (1 mM Endkonzentration) ausgesetzt. Abb. 8 zeigt, dass ACh am Tag 0 (Abb. 8A, E, durchschnittliche Fluoreszenzänderung (ΔF/F) = 2,58 ± 0,22) und am Tag 4 nach der Transdifferenzierung (Abb. 8B) eine Erhöhung des intrazellulären Ca2+ in WT-PSEN1-ChLNs induzierte ,G, (ΔF/F)=2,77 ± 0,14), mit einer mittleren Dauer von jeweils 10 s (n = 20 abgebildete ChLN-Zellen, N = 3 Schalen) entsprechend den zytoplasmatischen Ca2+-Reaktionen auf Fluo-3-vermittelte Bildgebung (Abb. 8F,H). Allerdings zeigten PSEN1 I416T-ChLNs eine verringerte intrazelluläre Ca2+-Einstromreaktion auf die ACh-Behandlung am Tag 0 (Abb. 8C,E, (ΔF/F) =1,19 ± 0,12) und 4 (Abb. 8D,G, (ΔF/F) = 0,78 ± 0,25, mittlere Dauer von 10 s (n = 20 abgebildete ChLN-Zellen, N = 3 Schalen)) im Vergleich zu WT-PSEN1-ChLNs (Abb. 8F, H).

PSEN1 I416T ChLNs zeigen eine verringerte funktionelle Reaktion auf Acetylcholin (ACh). Nach 7 Tagen Transdifferenzierung wurden WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium belassen, wie in der Abbildung angegeben. Zeitrafferbilder (0, 10, 20, 30, 40, 60 s) der Ca2+-Fluoreszenz in WT-PSEN1- und PSEN1-I416T-ChLNs nach 0 (A, C) und 4 Tagen (B, D) als Reaktion auf die ACh-Behandlung. ACh wurde bei 0 s in die Kultur gepumpt (Pfeil). Anschließend wurde die Ca2+-Fluoreszenz der Zellen zu den angegebenen Zeiten überwacht. Der Farbkontrast zeigt die Fluoreszenzintensität an: Dunkelblau < Hellblau < Grün < Gelb < Rot. (E, F) Diagramm, das ΔF/F und die Fläche unter der Kurve (AUC) von naiven und mutierten Zellen als Reaktion auf die ACh-Behandlung nach 0 Tagen zeigt. (G, H) Diagramm, das ΔF/F und die Fläche unter der Kurve (AUC) naiver und mutierter Zellen als Reaktion auf die ACh-Behandlung 4 Tage nach der Transdifferenzierung zeigt. Die Abbildungen repräsentieren 1 von 3 unabhängigen Experimenten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Wir untersuchten weiter, ob mutierte MenSCs in CSs transdifferenzierten und ob CSs die pathologischen Marker von FAD exprimieren können. Zu diesem Zweck wurden WT und mutierte MenSCs 11 Tage lang in Fast-N-Spheres-Medium kultiviert49. Wie in Abb. 9 gezeigt, transdifferenzierten sowohl WT- als auch mutierte MenSCs in CSs (Abb. 9A – D), wenn auch mit unterschiedlichen Zellprofilen. Während WT-CSs weder Amyloid (Abb. 9A'), oxidativen Stress (Abb. 9A"), p-TAU (Abb. 9C') noch den Apoptosemarker CASP-3 (Abb. 9C") aufwiesen, zeigten die I416T-CSs drückte einen signifikanten Anstieg von sAPPβf/Aβ-Aggregaten (4,0-fi, Abb. 9B',E), oxidiertem DJ-1 (8,85-fi, Abb. 9B",F) und p-TAU (10,55-fi, Abb. 9D) aus ',G) und CASP-3 (516,66-fi, Abb. 9D, H) im Vergleich zu WT-CSs (Abb. 9E–H). Darüber hinaus zeigen WT-CSs eine funktionelle Integrität der Mitochondrienmembran (Abb. 10A'), mutierte CSs zeigten jedoch eine signifikante Abnahme des ΔΨm (1,42-fd, Abb. 10B',C) im Vergleich zu WT-CSs.

PSEN1 I416T Zerebrale Sphäroide (CSs) zeigen hohe Werte an (i)sAPPβf, Ox-DJ-1, Tau-Phosphorylierung (p-TAU) und Caspase 3 (CASP3)-Aktivierung. Sowohl PSEN1 WT als auch I416T CSs wurden 11 Tage lang in Kultur belassen. Dann wurden die Kerne mit Hoechst (blau; A''-D'') gefärbt und die CSs wurden doppelt gefärbt, wie in der Abbildung gezeigt, mit Antikörpern gegen Ox-DJ-1 (grün; A'',B''). , (i)sAPPβf (rot; A',B'), CASP3 (grün; C'',D'') und p-Tau (rot; C',D') und zusammengeführt (A–D). Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der Reaktivität von iAPPβf (E), ox-DJ-1 (F), p-TAU (G) und CASP3 (H) aus Bildern, die durch Immunfluoreszenzanalyse von PSEN1 WT- und I416T-CSs erhalten wurden. Signifikante Werte wurden durch den Student-t-Test ermittelt; ***p < 0,001. Bildvergrößerung 20x.

PSEN1 I416T Zerebrale Sphäroide (CSs) zeigen einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (∆Ψm). Sowohl PSEN1 WT als auch I416T CSs wurden 11 Tage lang in Kultur belassen. Anschließend wurden die CSs (A'',B'') wie in der Abbildung gezeigt mit Hoechst (blau; A'',B'') und MitoTracker™ Red FM (rot: A',B') doppelt gefärbt. und zusammengeführt (A, B). (C) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von Bildern, die durch Fluoreszenzbildanalyse von PSEN1 WT- und I416T-CSs erhalten wurden. Signifikante Werte wurden durch den Student-t-Test ermittelt; ***p < 0,001. Bildvergrößerung 20x.

Wir haben auch getestet, ob CSs auf ACh reagieren. Abb. 11 zeigt die Reaktion von WT im Vergleich zu mutierten CSs, wenn sie mit ACh (1 mM) gepufft und mindestens 40 s lang aufgezeichnet wurden. WT-CSs zeigten einen hohen vorübergehenden Anstieg von Ca2+ nach innen (Abb. 11A, C; (ΔF/F) = 0,526 ± 0,02) mit einer mittleren Dauer von 10 s (n = 20 abgebildete ChLN-Zellen, N = 3 Schalen), wohingegen Mutanten CSs reagierten nahezu nicht auf ACh (Abb. 11B, C, (ΔF/F) = 0,024 ± 0,01) mit einer ähnlichen mittleren Dauer von 10 s (n = 20 abgebildete ChLN-Zellen, N = 3 Schalen, Abb. 11D)).

PSEN1 I416T Zerebrale Sphäroide (CSs) zeigen eine verminderte funktionelle Reaktion auf Acetylcholin (ACh). Sowohl PSEN1 WT als auch I416T CSs wurden 11 Tage lang kultiviert. (A, B) Zeitrafferbilder (Licht, 0, 10, 20, 30 und 40 s) der Ca2+-Fluoreszenz in CSs (n = 6 abgebildete CSs, N = 6 Schalen) als Reaktion auf die ACh-Behandlung. ACh wurde bei 0 s in die Kultur gepumpt (Pfeil). Anschließend wurde die Ca2+-Fluoreszenz der Zellen zu den angegebenen Zeiten überwacht. Der Farbkontrast zeigt die Fluoreszenzintensität an: Dunkelblau < Hellblau < Grün < Gelb < Rot. (C) Normalisiertes mittleres Fluoreszenzsignal (ΔF/F) über die Zeit, was auf einen zeitlichen Anstieg des zytoplasmatischen Ca2+ als Reaktion auf die ACh-Behandlung in PSEN1 WT- und I416T-CSs hinweist. Signifikante Werte wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit einem Tukey-Post-hoc-Test ermittelt; ***p < 0,001. Bildvergrößerung 20x.

Schließlich messen wir das Verhältnis von Aβ42 zu Aβ40 in CSs. Wie in Abb. 7C gezeigt, erzeugten mutierte CSs einen signifikant höheren Grundspiegel von Aβ40 (+2,27-fach) als WT, aber PSEN 1 I416T CSs erzeugten signifikant mehr Aβ42 (+6,18-f) als WT. Das Verhältnis von Aβ42 zu Aβ40 zeigt deutlich, dass mutierte CSs mehr Aβ42 (3,28-f) erzeugten als WT-CSs (1,21-f, Abb. 7D).

Die Entwicklung planarer (2D) und dreidimensionaler (3D) In-vitro-Modelle wie immortalisierte und iPSCs-Zelllinien oder organähnlicher Modelle hat wesentlich zum Verständnis der zellulären und molekularen neuropathophysiologischen Merkmale von AD50,51,52 beigetragen. Sie sind jedoch teuer und zeitaufwändig45,46. In der vorliegenden Studie konnten wir die Neuropathologie von AD in von MenSCs abgeleiteten PSEN1 I416T ChLNs in 2D und 3D (zerebrale Sphäroide) in vitro in 11 Tagen unter Verwendung von Cholinergic-N-Run53 bzw. Fast-N-spheres-Medium49 reproduzieren . Wir berichten zum ersten Mal, dass PSEN1 I416T ChLNs die typische intrazelluläre Aggregation von Protein Aβ (am Tag 7) und eine Überproduktion von eAβ42 (am Tag 11), p-TAU (am Tag 11) und Mitochondrienschäden (am Tag 11) zeigten. OS (am Tag 7) und Apoptose (am Tag 11). Darüber hinaus reagierten PSEN1 I416T-ChLNs, jedoch nicht WT-ChLNs, nicht auf das ACh-induzierte Ca2+-Einwärtssignal (am Tag 11). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die intrazelluläre Aggregation von Aβ und OS und nicht die extrazelluläre Aβ die frühesten molekularen Ereignisse sind, die am Verlust neuronaler Zellen bei FAD beteiligt sind. In Übereinstimmung mit postmortalen AD-Gehirnen54,55, In-vitro-27,56 und In-vivo-Studien54,57,58,59 fanden wir iAPPβf/Aβ-Aggregate in PSEN1 I416T ChLNs bereits 7 Tage nach der Transdifferenzierung von MenSCs. Diese Beobachtung spiegelt die Ergebnisse in PSEN 1 E280A27 wider. Allerdings ist die Identität der iAβ-Spezies noch nicht vollständig geklärt. Tatsächlich haben Forscher neben anderen Aβ-Arten entweder iAβ42, iAβ4527 oder iAPPβf27 identifiziert60,61. Diese Ergebnisse lassen sich möglicherweise durch die für den Nachweis verwendete Technik erklären, beispielsweise Immunhistochemie und Immunfluoreszenzmikroskopie, bei der Antikörper gegen verschiedene Aβ-Konformationen (z. B. 6E10, 4G8, Anti-Aβ45) verwendet werden. Interessanterweise konnten wir mithilfe von Massenspektrometrieanalyse und Immunfluoreszenzmikroskopie (6E10) mehrere APP-Fragmente identifizieren (z. B. APP714, APP733, APP751, APP752, zusammen als sAPPβf bezeichnet), in PSEN 1 E280A ChLNs27 wurde jedoch kein Aβ42-Fragment identifiziert. Was auch immer die wahre Natur von Aβ sein mag, es reichert sich intrazellulär an54,62. Wie bei von MSCs abgeleiteten PSEN 1 E280A-ChLNs fanden wir nach 7 Tagen Transdifferenzierung (Tag 0) eine intrazelluläre APPβf-Akkumulation in von MenSCs abgeleiteten PSEN1 I416T-ChLNs. Interessanterweise haben wir auch Aβ-Aggregate in PSEN 1 I416T CSs entdeckt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass sich intrazelluläre APPβ/Aβ-Fragmente aufbauen, weil die APP-Verarbeitung in voller Länge verändert ist und folglich einige APP-Fragmente intrazellulär verbleiben63,64. Wie genau APPβf/Aβ in PSEN 1 I416T (oder E280A und anderen Mutationen) erzeugt wird, ist noch nicht vollständig geklärt. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Verarbeitung von APP ein dynamischer biologischer Prozess ist, der vom kinetischen Enzymabbau und der zellulären Lokalisierung sowohl der β- als auch der γ-Sekretase abhängt. In einer normalen Nervenzelle wird APP nacheinander durch β-Sekretase (BACE1) gespalten, wodurch ein lösliches proteolytisches Fragment freigesetzt wird, das als lösliches APPβ (sAPPβ) erkannt wird und möglicherweise internalisiert und an Endosomen im extrazellulär sezernierten amyloidogenen Weg abgegeben wird. Das verbleibende C-terminale membrangebundene APP-Fragment, CTFβ oder C99-Fragment, wird durch PSEN1/γ-Sekretase zusätzlich gespalten, um hauptsächlich Aβ40-Fragmente (90 %, nichtamyloidogen) und Aβ42 (10 %, amyloidogen) zu erzeugen. Die Aβ-Peptide werden dann in den extrazellulären Raum sezerniert, wenn das Endosom zur Zelloberfläche zurückkehrt65. In einer mutierten Nervenzelle wird APP normalerweise durch BACE1 gespalten, wodurch APPβf entsteht, das durch einen noch unbekannten Mechanismus intrazellulär, wahrscheinlich in frühen Endosomen, stecken bleibt66. Da die meisten Mutationen in PSEN1, einschließlich I416T / E280A, die enzymatische Aktivität der γ-Sekretase verringerten33, schneidet es bevorzugt an der γ-Stelle und wird zu einer Hauptproduktlinie67, die eAβ4268 überproduziert. Da es sich bei der I416T-Mutation außerdem möglicherweise auch um eine transdominante negative Mutation der γ-Sekretase handelt32,69, könnte das von APP abgeleitete eAβ42-Fragment ein spätes Ereignis im Prozess der neuronalen Zellentlassung sein. Dieser Ansicht folgend entdeckten wir frühes iAPPβf/iAβ (am Tag 7) und spätes eAβ42 (am Tag 11) in I416T 2D und 3D. Tatsächlich erhöhte die Expression der I416T-Mutation die Aβ42-Spiegel, verringerte jedoch die Aβ40-Spiegel, was insgesamt zu einem Anstieg des Aβ42/Aβ40-Verhältnisses im Vergleich zu den WT-PSEN 1 führte. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die PSEN1 L166P- und G384A-Mutationen eine Neulokalisierung von verursachen γ-Sekretase in MNT-1-Zellen (hochpigmentierte menschliche Melanomzellen), die die Bildung von intrazellulärem langem Aβ4270 erheblich fördert. Daher legen unsere Daten nahe, dass die PSEN 1 I416T-Mutation die intraneuronalen APPβf/Aβ-Aggregate sowohl in ChLNs als auch in CSs stark verstärkt und dadurch eine Vielzahl intrazellulärer Signalmechanismen auslöst, die zum neuronalen Zelltod führen. In Übereinstimmung mit anderen71 deuten diese Daten darauf hin, dass die Akkumulation von iAPPβf/Aβ der erste Schritt einer tödlichen Kaskade ist.

Zuvor wurde gezeigt, dass die Oxidation des oxidativen Sensorproteins DJ-1106-SOH (Thiolat) zu DJ-1106-SO3 (Sulfonsäure) durch H2O2 und die Produktion von ROS gleichzeitige Ereignisse beim Nachweis von Aβ-Aggregaten in MSCs waren PSEN 1 E280A ChLNs27. Hier beobachteten wir ein ähnliches Phänomen sowohl bei den von MenSCs abgeleiteten ChLNs I416T als auch bei CSs. Allerdings ist die biochemische Quelle von ROS/H2O2, die durch APPβf/Aβ erzeugt wird, noch nicht definiert. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass Aβ möglicherweise mit Mitochondrien interagiert und die Elektronentransportkette unterbricht, wodurch Elektronen an Sauerstoff abgegeben werden und die ROS-Produktion und H2O272 erhöht werden. Interessanterweise war die ROS (H2O2)-Produktion am Tag 0 höher als am Tag 4 nach der Transdifferenzierung, wohingegen am Tag 4 ein Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und der Expression pathologischer Marker beobachtet wurde. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die H2O2-Erzeugung ein vorübergehendes (kurzlebiges) zelluläres Ereignis ist ) und hochreaktiv gegenüber anderen Molekülen durch oxidative Modifikation kritischer redoxempfindlicher Cys (z. B. DJ-1)73. Sobald es Zielmoleküle einschließlich Transkriptionsfaktoren (TFs), Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) und Protein-Tyrosinphosphatasen74,75 direkt/oder indirekt aktiviert hat, verschwindet es. Zusammengenommen stimmen diese Beobachtungen mit der Annahme überein, dass H2O2 als sekundärer Botenstoff fungiert74,76. Im Einklang mit diesen Erkenntnissen induziert die mitochondrienspezifische Akkumulation von Amyloid-β/H2O2 eine mitochondriale Dysfunktion, die zum apoptotischen Zelltod führt77. Tatsächlich fanden wir heraus, dass die ChLNs I416T und CSs einen signifikanten Verlust von ΔΨm aufwiesen und mehrere Marker exprimierten, die mit dem regulierten Zelltod verbunden sind. Tatsächlich zeigten ChLNs I416T zwei wichtige aktive proapoptotische Transkriptionsfaktoren: c-JUN78 und P5379. Interessanterweise induzieren sowohl c-JUN als auch P53 Apoptose durch direkte transkriptionelle Aktivierung des proapoptotischen BH3-only-Proteins PUMA80,81,82. Sobald PUMA hochreguliert ist, bindet es die Mitochondrien an die Mitochondrien-Außenmembranpermeabilisierung (MOMP), was die Freisetzung von pro-apoptogenem Protein (z. B. Cytochrom c) und die Aktivierung des Executor-Proteins CASPASE-383 ermöglicht. Wie erwartet zeigten PSEN 1 I416T ChLNs und CSs gleichzeitig einen Verlust von ΔΨm und eine Überexpression von CASPASE-3, was auf Zelltod durch Apoptose hinweist. In Übereinstimmung mit anderen57,84,85,86 deuten unsere Daten darauf hin, dass APPβf/Aβ Apoptose in I416T-ChLNs und mutierten CSs induziert. Trotz überwältigender Beobachtungen haben andere Forscher vorgeschlagen, dass iAβ andere Arten des neuronalen Zelltods wie Oxytose/Ferroptose87, Autophagie88 und Nekrose89 induziert. Wir schließen daher nicht die Möglichkeit aus, dass die I416T-Mutation nicht nur Apoptose, sondern auch andere zusätzliche Zelltode in ChLNs auslösen könnte. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um dieses Problem aufzuklären.

Die Hyperphosphorylierung des Proteins TAU scheint ein kritischer Marker für Neurodegeneration bei AD90 zu sein. Tatsächlich ist bekannt, dass p-TAU an Ser202/Thr205 in postmortalen Gehirnen von AD91 erhöht ist und die p-TAU-Spiegel in späteren Stadien von AD92 ansteigen. Wir haben p-TAU (Ser202/Thr205) sowohl in MenSCs-abgeleiteten I416T-ChLNs als auch in CSs nach 11 Tagen der Transdifferenzierung nachgewiesen, aber APPβf/Aβ-Aggregation am Tag 7. In Übereinstimmung mit anderen93,94 deuten unsere Daten darauf hin, dass APPβf/Aβ p- TAU. Eine ähnliche Schlussfolgerung wurde mit MSCs-induzierten PSEN 1 E280A ChLNs27 gezogen. Wie genau APPβf/Aβ die Hyperphosphorylierung von TAU auslöst, ist jedoch noch nicht geklärt. Eine Möglichkeit besteht darin, dass APPβf/Aβ die Phosphorylierung von TAU durch die c-JUN-N-terminale Kinase (JNK)-Signalisierung induziert95. Da JNK sowohl das proapoptotische Protein c-JUN als auch TAU bei (Ser202/Thr205) phosphoryliert und aktiviert werden kann, ist diese Kinase zu einem potenziellen therapeutischen Ziel geworden96.

Calciumflüsse sind eng an der neuronalen Funktionalität beteiligt97. Es ist zu erwarten, dass eine neuronale Kalziumdyshomöostase mit AD in Zusammenhang steht, da gestörtes Ca2+ zu synaptischen Defiziten und Gedächtnisverlust führen kann98. Wir fanden heraus, dass sowohl PSEN 1 I416T-ChLNs als auch CSs im Vergleich zu WT-ChLNs/CSs nahezu nicht auf den ACh-induzierten Ca2+-Einstrom reagierten. Eine mögliche Erklärung ist, dass eAβ42 die Ligand-Rezeptor-Interaktion durch direkte Hemmung von Alpha-7-nACh-Rezeptoren beeinträchtigen könnte99. Dieser Ansicht folgend stellten wir fest, dass PSEN 1 I416T ChLNs und CSs große Mengen an eAβ42 erzeugten. Obwohl die Natur von AChRs in neuronalen I416T-Zellen noch nicht bekannt ist, lässt die schnelle Reaktion von ChLNs auf den ACh-induzierten Ca2+-Einstrom in neuronalen WT-Zellen darauf schließen, dass WT und mutierte ChLNs und CSs präsynaptische nAChRs exprimierten100. Tatsächlich beeinflusst eAβ42 neuronale Ca2+-Zellen nach innen. Daher stellt der Acetylcholinrezeptor ein potenzielles therapeutisches Ziel für FAD dar.

Der I416T ist die zweithäufigste Mutation in PSEN 1 in Kolumbien34. Interessanterweise ähnelt der klinische Phänotyp dieser Mutation den klinischen Merkmalen der Mutation PSEN 1 E280A, der häufigsten Mutation in der „Paisa“-Region8. Obwohl neuropathologische Untersuchungen postmortaler Gehirne und biochemische Studien für I416T noch begrenzt sind, zeigen wir in vitro, dass von PSEN 1 I416T MenSCs abgeleitete ChLNs und CSs die typischen pathologischen Merkmale von sporadischer AD und PSEN 1 E280A FAD27 widerspiegeln, wie z. B. intrazelluläre Aggregation von APPβf, Sekretion von eAβ42 und Phosphorylierung von Protein Tau (Tabelle 1). Obwohl sich die Mutationen E280A und I416T im Protein PSEN 1 strukturell unterscheiden, deuten unsere Beobachtungen darauf hin, dass I416T auch die katalytische Wirkung von PSEN 1/γ-Sekretase deaktiviert. Ob jedoch der Austausch eines Isolins (hydrophober Rest) gegen eine Threonin-Aminosäure (ungeladener Rest) am Codon 416 die 3D-Struktur von PSEN 1 stört, wie dies bei E280A der Fall ist (saurer zu hydrophober Rest)30, bedarf weiterer Untersuchungen. Unabhängig von der strukturellen Veränderung löst I416T die iAPPβf-Aggregation, eAβ42 und p-TAU in ChLNs/CSs aus, unabhängig von der ethnischen Herkunft (z. B. Afrikaner vs. Europäer (E280A)). Darüber hinaus verursacht diese Mutation OS und Zelltod durch Apoptose in ChLN und CSs, was sich in einem signifikanten Anstieg der Oxidation des Sensorproteins DJ-1, der Aktivierung des proapoptotischen Proteins c-JUN und P53, der Expression von PUMA und der Aktivierung von Executor widerspiegelt Protein CASP3. Die vorliegenden Ergebnisse spiegelten natürlich zum ersten Mal die neuropathologischen Merkmale von FAD PSEN 1 I416T wider. Angesichts der Tatsache, dass I416T den pathologischen Wirkungen von E280A ähnelt und diese letzte Mutation sowohl Aβ40 als auch Aβ42 verringerte, das Verhältnis Aβ42/Aβ40 jedoch Aβ4233 begünstigte, gehen wir davon aus, dass in Kolumbien weitere PSEN-1-bezogene Mutationen identifiziert wurden (z. B. P117A, I143T, H163A)34 könnte zu ähnlichen Phänotypen wie I416T/E280A-Mutationen führen, wobei es zu einer Überproduktion von iAPPβf in ChLNs oder CSs kommt. Es wäre interessant zu testen, ob andere Mutationen, die weniger Aβ42 produzieren als (z. B. D333G, T354I, N405S, A409T) oder gleich WT PSEN 1 (z. B. I439V), oder Mutationen mit extrem hoher Produktion von Aβ42 (G384A)33, sind auch dem I416T-Phänotyp ähnlich. Aufgrund der Herkunft der MenSCs beschränken sich die vorliegenden Beobachtungen auf das weibliche Geschlecht. Zu Bestätigungszwecken sollten jedoch aus männlichem Gewebe (z. B. Zahnpulpa, Adipozytengewebe) stammende MSCs in zukünftige Versuchsumgebungen einbezogen werden. Weitere Untersuchungen zu diesen Fragen sind garantiert. Wir fanden jedoch durchgängig iAPPβf in beiden I416T/E280A-ChLNs bereits nach 7 Tagen der Transdifferenzierung. Diese Beobachtungen könnten zum Verständnis der wiederkehrenden Misserfolge klinischer Studien mit Anti-eAβ101 beitragen und die Ansicht stützen, dass FAD durch die Akkumulation anderer intrazellulärer APP-Metaboliten und nicht durch eAβ42102 ausgelöst wird. Daher sollten andere alternative Behandlungsansätze für FAD verfolgt werden.

Die vorliegende Studie wurde von der Universität Antioquia, Medellín, Kolumbien, genehmigt. Die Menstruationsblutproben wurden von einer gesunden (Tissue Bank Code, TBC # 69308) und asymptomatischen FAD (TBC # 45000) Frau im Alter zwischen 18 und 25 Jahren entnommen. Die Spender legten eine unterzeichnete Einverständniserklärung vor, die von der Ethikkommission der Sede de Investigación Universitaria (SIU) der Universität Antioquia, Medellín, Kolumbien (Gesetz Nr. 19–10-846) genehmigt wurde. Alle Experimente und/oder Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die von der Universität Antioquia, Medellín, Kolumbien, genehmigt wurden. Menstruationsblut (MenB) wurde in den ersten drei Tagen der Menstruation durch eine Bechersammlung (10–15 ml) gesammelt. Kurz gesagt, Menstruationsblutproben wurden ins Labor geliefert und mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), das 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt, mit 100 U/ml Penicillin/Streptomycin und 0,25 mg/ml Amphotericin B gemischt und innerhalb von 24 Stunden einer Zelllyse oder Standard-Ficoll-Verfahren unterzogen, wie zuvor beschrieben103. Nach der Zentrifugation wurden die in einem Leukozytenfilm suspendierten Zellen (7,7 × 106 ± 3 × 106 Zellen, n = 3) in ein neues Röhrchen überführt, zweimal in PBS gewaschen und in Wachstumsmedium (DMEM-Medium mit niedrigem Glucosegehalt, ergänzt mit 10) suspendiert % FBS (Gibco, USA), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin 0,25 mg/ml Amphotericin B) und in 25 cm2 große Zellkulturflaschen aus Kunststoff bei 37 °C mit 5 % angefeuchtetem CO2 ausgesät. Das Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht, wobei die anhaftenden Zellen zurückblieben, die als fibroblastische Zellen in Clustern wuchsen. Als die Zellen eine Konfluenz von 80–90 % erreichten (Passage 0, P0), wurden die Zellen mit 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA abgelöst und im Verhältnis 1:3 in neue Flaschen subkultiviert. Die isolierten MenSCs wurden auf ihre Differenzierungskapazität in eine Osteoblasten-, Chondrozyten- und Adipozytenlinie sowie auf das Vorhandensein cholinerger neuronaler Marker (z. B. Cholinacetyltransferase, ChAT; vesikulärer Acetylcholintransporter, VAChT) gemäß53,104,105 untersucht.

Die PSEN1 I416T-Mutation wurde durch PCR unter Verwendung von Mismatch-Primern und Verdau der Produkte mit VspI (AseI-Isoschizomer) gemäß35 nachgewiesen. Die verdauten Produkte wurden auf einem 3 %igen Agarosegel aufgetrennt. Gemäß unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitätsmustern wurden die Proben im Vergleich zum PSEN1 I416T-Träger (positiver DNA-(Kontroll-)Fall NeuroBank Hinweis: Code Nr. 2495). Die Probe TBC Nr. 45.000 (weiblich) wurde für die Mutation PSEN1 I416T identifiziert, während die Probe TBC Nr. 69.308 (weiblich) für WT PSEN1 identifiziert wurde. Zu Vergleichszwecken haben wir die E280A PSEN1-DNA-Probe (TBC# 271) als interne Kontrolle einbezogen.

Die osteogene Differenzierung wurde gemäß 104 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, WT und mutierte MenSCs in den Passagen 4–7 wurden mit einer Dichte von 10.000 Zellen/cm2 in Platten mit 12 Vertiefungen in einem normalen Kulturmedium ausplattiert. Nach 72 Stunden wurde das Kulturmedium durch osteogenes Differenzierungsmedium ersetzt, das DMEM mit hohem Glucosegehalt (Sigma), 10 % FBS, 1 µM Dexamethason (Alfa Aesar, Kat.-Nr. A17590), 250 µM Natriumascorbat (Sigma, Kat.-Nr. A4034) enthielt. und 10 mM β-Glycerophosphat (Alfa Aesar, Kat.-Nr. L03425). Das Medium wurde alle 3–4 Tage gewechselt. Kontrollzellen wurden in normalem Kulturmedium (RCm) gehalten. Nach 20 Tagen der Induktion wurden die Zellen in 4 % FA fixiert und mit dem monoklonalen Maus-Anti-Human-Osteocalcin-Antikörper (1:500; F&E, Kat.-Nr. MAB1419) inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit dem Anti-Maus-Sekundärantikörper DyLight™ 594 (1: 500) und 1 μM Hoechst 33.342 (Life Technologies).

Die adipogene Differenzierung wurde gemäß 104 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, WT und mutierte MenSCs in den Passagen 4–7 wurden mit einer Dichte von 20.000 Zellen/cm2 in einer Platte mit 12 Vertiefungen in einem normalen Kulturmedium ausplattiert. Bei 90–100 % Konfluenz wurde das Kulturmedium durch adipogenes Induktionsmedium ersetzt, einschließlich DMEM mit hohem Glucosegehalt, 10 % FBS, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (Sigma, Kat.-Nr. I5879), 100 µM Indomethacin (Sigma, Kat.-Nr. I7378), 0,1 µM Dexamethason und 10 µg/ml Insulin. Kontrollzellen wurden in normalem Kulturmedium gehalten. Nach 20 Tagen der Induktion wurden die Zellen in 4 % FA fixiert und mit dem affinitätsgereinigten polyklonalen Anti-Maus-Fettsäure-bindendes Protein 4 (FABP4)-Antigen der Ziege (1:500; F&E, Kat.-Nr. AF3150) inkubiert, gefolgt von Inkubation mit Anti-Ziegen-Sekundärantikörper DyLight™ 594 (1:500) und 1 μM Hoechst 33.342 (Life Technologies).

Die chondrogene Differenzierung wurde gemäß 105 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, 5 × 104 WT und mutierte MenSCs wurden in Mikrotiterplatten aggregiert belassen und dann mit chondrogenem Medium versorgt, das DMEM mit hohem Glucosegehalt, 10 % FBS, 10 μg/l TGF-β3, 0,1 μmol/l Dexamethason und 50 μmol/l Vitamin enthielt C und 6,25 mg/L Insulin. Das Medium wurde alle 3–4 Tage gewechselt. Kontrollzellen wurden in einem normalen Kulturmedium gehalten. Nach 20 Tagen der Induktion wurden die Zellen in 4 % FA fixiert und mit dem affinitätsgereinigten polyklonalen Ziegen-Anti-Human-Aggrecan-Antigen-Antikörper (1:500; F&E, Kat.-Nr. 967.800) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Anti-Ziegen-DyLight™ 594 sekundär Antikörper (1:500) und 1 μM Hoechst 33.342 (Life Technologies).

Die MenSCs wurden mit 1,6–2 × 104 Zellen/cm2 in 25-cm2-Kulturflaschen für 24 Stunden in normalem Kulturmedium ausgesät. Dann wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden entweder in Minimalkulturmedium (MCm) oder cholinergem Differenzierungsmedium (Cholinergic-N-Run-Medium mit DMEM/F-12-Medium 1:1 Nährstoffmischung Gibco (Kat.-Nr. 10.565.018, 10 ng/min) inkubiert. ml), rekombinantes menschliches Protein des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) (Gibco Kat.-Nr. 13.256.029), 50 µg/ml Natriumheparin (Sigma-Aldrich Kat.-Nr. H3393), 0,5 µM all-trans-Retinsäure, 50 ng/ml Sonic-Hedgehog-Peptid (SHH, Sigma Kat.-Nr. SRP3156) und 1 % FBS) bei 37 °C für 0 und 4 Tage gemäß53.

MenSCs wurden mit einer Dichte von 1,5 × 104 Zellen/cm2 in einer Platte mit mehreren Vertiefungen (Grinner-Bio-one, Kat.-Nr. 662102) unter Verwendung von Fast-N-Spheres-Medium (DMEN F-12 GIBCO®, Kat.-Nr. 11.330–032) ausgesät ; ergänzt mit 2 % B27® GIBCO® (Kat.-Nr. 17504-044), 20 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, R&D Systems, Inc., MN), 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, Sigma-Kat.-Nr. E9644), 1 µg/ml Heparin-Natriumsalz® und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin für 11 Tage gemäß49.

Für die Analyse von neuralen, Alzheimer-Krankheits-, oxidativen Stress- und Zelltod-bezogenen Markern wurden die unter verschiedenen Bedingungen behandelten Zellen 20 Minuten lang mit kaltem Ethanol (–20 °C) fixiert, gefolgt von Triton X-100 (0,1 %). ) Permeabilisierung und Blockierung durch 10 % Rinderserumalbumin (BSA). Die Zellen wurden über Nacht mit primären neuronalen Antikörpern gegen Cholin-Acetyltransferase (ChAT, 1:500, Kat.-Nr. AB144 P, Millipore) und vesikulären Acetylcholintransporter (VAChT, 1:500, Kat.-Nr. SAB4200559, Sigma) inkubiert; Primärantikörper gegen APP751 und/oder Protein Amyloid β1–42 (1:500; Klon 6E10, Kat.-Nr. 803014, Biolegend), Gesamt-TAU (1:500; t-Tau; Kat.-Nr. T6402, Sigma) und Phospho-TAU (S -Tau, 1:500, Ser202/Thr205, Kat.-Nr. MN1020 (AT8), Thermo Fisher Scientific); und primäre Antikörper gegen oxidiertes DJ-1 (1:500; ox(Cys106)DJ1; über den Rest C106 von menschlichem PARK7/DJ1; oxidiert, um Cysteinsulfonsäure (SO3) zu produzieren; Kat.-Nr. MABN1773, Millipore). Um den Zelltod zu beurteilen, verwendeten wir Primärantikörper gegen p53-hochregulierten Modulator der Apoptose (1:500; PUMA, Kat.-Nr. ab-9643, Abcam), p53 (1:500; Kat.-Nr. MA5-12-453, Millipore) und Phospho -c-Jun (1:250; c-Jun (S63/73) Kat.-Nr. sc-16312, Santa Cruz) und Caspase-3 (1:250; Kat.-Nr. AB3623, Millipore). Nach gründlichem Spülen inkubierten wir die Zellen mit sekundären fluoreszierenden Antikörpern (DyLight 488 und 594 Pferd Anti-Kaninchen, -Ziege und -Maus, Katze DI 1094, DI 3088 bzw. DI 2488) bei 1:500. Die Kerne wurden mit 1 μM Hoechst 33.342 (Life Technologies) gefärbt und Bilder wurden mit einem Floyd Cells Imaging Station-Mikroskop aufgenommen. Die Fluoreszenzintensität wurde gemäß106 mit dem Programm Image J (https://imagej.net/)107 berechnet.

Um den Gehalt an intrazellulärem ROS zu bestimmen, verwendeten wir 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (5 μM, DCFH2-DA; Invitrogen) gemäß108. ChLNs wurden 0 und 4 Tage lang in normalem Kulturmedium (RCm) belassen. Anschließend wurden die Zellen (5 × 103) mit dem DCFH2-DA-Reagenz 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und die Fluoreszenzintensität von Dichlorfluorescein (DCF) wurde durch Analyse von Fluoreszenzmikroskopiebildern bestimmt109. Die Kerne wurden mit 0,5 μM Hoechst 33.342 (2,5 μM) Färbemittel gefärbt. Die Bewertung wurde dreimal in unabhängigen, für den Experimentator blinden Experimenten wiederholt.

ROS wurde mit 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (1 μM, DCFH2-DA) gemäß 108 bestimmt. ChLNs wurden 0 und 4 Tage lang in RCm belassen. Anschließend wurden die Zellen (1 × 105) mit DCFH2-DA-Reagenz 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und die DCF-Fluoreszenz mit einem LSRFortessa (BD Biosciences) bestimmt. Die Bewertung wurde dreimal in unabhängigen Experimenten wiederholt. Quantitative Daten und Zahlen wurden mit der Datenanalysesoftware FlowJo7.6.2 ermittelt. Die Bewertung wurde dreimal in unabhängigen Experimenten wiederholt, blind für den Experimentator und den Durchflusszytometer-Analysten110.

Die ChLNs und CSs wurden jeweils 0, 4 bzw. 11 Tage in RCm belassen. Anschließend wurden die Zellen (5 × 103) mit der passiv diffundierenden und aktiven Mitochondrien akkumulierenden tiefroten MitoTracker-Farbstoffverbindung (20 nM, Endkonzentration) 20 Minuten lang bei RT im Dunkeln (Invitrogen, Kat.-Nr. M22426) gemäß 111 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Die Fluoreszenzintensität des MitoTracker wurde durch Analyse von Fluoreszenzmikroskopiebildern bestimmt. Die Kerne wurden mit 0,5 μM Hoechst 33.342 (2,5 μM) Färbemittel gefärbt. Die Bewertung wurde dreimal in unabhängigen Experimenten wiederholt, blind für den Experimentator und den Durchflusszytometer-Analysten.

ChLNs wurden 0 und 4 Tage lang in RCm belassen. Anschließend wurden die Zellen (1 × 105) 30 min bei RT im Dunkeln mit MitoTracker (20 nM, Endkonzentration) gemäß111 inkubiert. Die Zellen wurden mit einem LSRFortessa (BD Biosciences) analysiert. Das Experiment wurde dreimal in unabhängigen Experimenten durchgeführt und 10.000 Ereignisse wurden zur Analyse erfasst. Quantitative Daten und Zahlen wurden mit der Datenanalysesoftware FlowJo 7.6.2 ermittelt. Die Bewertung wurde dreimal in unabhängigen Experimenten wiederholt, blind für den Experimentator und den Durchflusszytometer-Analysten.

Der Gehalt an Aβ1–42-Peptid wurde gemäß einem früheren Bericht112 mit geringfügigen Änderungen gemessen. Kurz gesagt, WT- und PSEN1 I416T-ChLNs oder CSs wurden 4 bzw. 11 Tage lang in RCm belassen. Dann wurden 100 μl konditioniertes Medium gesammelt und die Konzentrationen der sekretierten Aβ1–42-Peptide wurden durch einen Festphasen-Sandwich-ELISA (Invitrogen, Kat.-Nr. KHB3544) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Bewertung wurde dreimal in unabhängigen, für den Experimentator blinden Experimenten wiederholt.

Die zytoplasmatische Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) wurde gemäß Lit. 113 gemessen. Kurz gesagt, ChLNs, die 0 und 4 Tage lang in Ch-N-Rm kultiviert wurden, und CSs, die 11 Tage lang in Fast-N-spheres-Medium kultiviert wurden, wurden in eine Badlösung (NBS; in mM: 137 NaCl, 5 KCl, 2,5 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,3 und 22 Glucose) mit einem Ca2+-empfindlichen Indikator (2 µM Fluo3-AM, eine Acetoxymethylesterform des Fluoreszenzfarbstoffs Fluo-3; Thermo Fisher Scientific Cat F1242) für 30 Minuten bei RT und dann fünfmal gewaschen. Die intrazellulären Ca2+-Transienten wurden durch Acetylcholin (ACh, 1 mM final) hervorgerufen. Vor Beginn der Aufnahmen wurden im Gesichtsfeld der Kamera mehrere „Regions of Interest“ (ROIs) definiert. Einer der ROIs war zellfrei und die hier gemessene Fluoreszenzintensität wurde als „Hintergrundfluoreszenz“ (Fbg) betrachtet. Im Modus „kinetische Ansicht“ berechnete und zeigte das Programm die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten der ROIs in willkürlichen Einheiten (AUs) als Funktion der Zeit an. Im Modus „Bildansicht“ wurde die Zeitabhängigkeit der räumlichen Verteilung der Fluoreszenzemission dargestellt, die Fluoreszenzintensitäten (daher die Ca2+-Gehalte) wurden entweder durch Pseudofarben dargestellt. Um die Änderungen der durchschnittlichen Ca2+-bezogenen Fluoreszenzintensitäten im Modus „kinetische Ansicht“ zu berechnen, wurde zunächst der Fbg-Wert aus dem zellfreien ROI bestimmt, dann wurden die Ruhefluoreszenzintensitäten (Frest) der zellhaltigen ROIs ermittelt als Durchschnitt der Punkte, die während eines Zeitraums von 10 s vor der Zugabe von ACh aufgezeichnet wurden. Die Peaks der Fluoreszenztransienten wurden ermittelt, indem der Durchschnitt von drei aufeinanderfolgenden Punkten berechnet und diejenigen Punkte identifiziert wurden, die den höchsten Durchschnittswert (Fmax) ergaben. Die Amplituden der Ca2+-bezogenen Fluoreszenztransienten wurden relativ zur Ruhefluoreszenz (ΔF/F) ausgedrückt und nach der Formel ΔF/F = (Fmax − Frest)/(Frest − Fbg) berechnet. Die Fluoreszenzintensität wurde wie von106 beschrieben mit dem Image J-Programm (https://imagej.net/)107 berechnet.

Lichtmikroskopische Fotos und Fluoreszenzmikroskopiefotos wurden genau wie zuvor von27 berichtet mit einem Zeiss Axiostart 50 Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer Zeiss AxioCam Cm1 und einem Floyd Cells Imaging Station Mikroskop, aufgenommen und analysiert. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde durch Normalisierung der Gesamtfluoreszenz auf die Anzahl der Kerne ermittelt.

Dieser Versuchsaufbau wurde genau wie zuvor von49 beschrieben durchgeführt, basierend auf den in von114 beschriebenen statistischen Überlegungen. Unter der Voraussetzung, dass die Daten der Versuchseinheit (d. h. des Bohrlochs) die Unabhängigkeit von Beobachtungen erfüllen, die abhängige Variable in jeder Behandlungsgruppe normalverteilt ist (Shapiro-Wilk-Test) und die Varianzen homogen sind (Levene-Test), wurde die statistische Signifikanz bestimmt durch T-Test des Schülers, einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA, gefolgt von einem Post-hoc-Vergleich nach Bonferroni oder Tukey, berechnet mit der Software GraphPad Prism 5.0. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden nur bei einem p-Wert von < 0,05 (*), < 0,001 (**) und < 0,001 (***) als signifikant angesehen. Alle Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt

Spender von Menstruationsproben legten eine unterzeichnete Einverständniserklärung vor, die von der Ethikkommission des University Research Headquarters (SIU) der Universität Antioquia, Medellín, Kolumbien (Gesetz 2020-10854) genehmigt wurde.

Die Einverständniserklärung aller in die Studie einbezogenen Einzelteilnehmer wurde eingeholt.

Alle für diese Studie generierten Datensätze sind im Manuskript enthalten.

Wolfe, MS et al. Zwei transmembranöse Aspartate in Presenilin-1, die für die Presenilin-Endoproteolyse und die γ-Sekretase-Aktivität erforderlich sind. Natur 398, 513–517. https://doi.org/10.1038/19077 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Khan, AA, Ali, RH & Mirza, B. Evolutionsgeschichte der Alzheimer-Krankheit verursachenden Proteinfamilie Preseniline mit pathologischen Auswirkungen. J. Mol. Entwicklung 88, 674–688. https://doi.org/10.1007/s00239-020-09966-w (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Hur, J.-Y. γ-Sekretase bei der Alzheimer-Krankheit. Exp. Mol. Med. 54, 433–446. https://doi.org/10.1038/s12276-022-00754-8 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sherrington, R. et al. Klonierung eines Gens, das Missense-Mutationen bei früh einsetzender familiärer Alzheimer-Krankheit trägt. Natur 375, 754–760. https://doi.org/10.1038/375754a0 (1995).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Dai, M.-H., Zheng, H., Zeng, L.-D. & Zhang, Y. Die Gene, die mit der früh einsetzenden Alzheimer-Krankheit verbunden sind. Oncotarget 9, 15132–15143. https://doi.org/10.18632/oncotarget.23738 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Clark, RF et al. Die Struktur des Presenilin-1-Gens (S182) und die Identifizierung von sechs neuen Mutationen in AD-Familien mit frühem Ausbruch. Nat. Genet. 11, 219–222. https://doi.org/10.1038/ng1095-219 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Lalli, MA et al. Ursprung der PSEN1 E280A-Mutation, die eine früh einsetzende Alzheimer-Krankheit verursacht. Alzheimer-Demenz. 10, S277–S283. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2013.09.005 (2014).

Artikel Google Scholar

Lopera, F. et al. Klinische Merkmale der früh einsetzenden Alzheimer-Krankheit bei einem großen Stamm mit einer E280A-Präsenilin-1-Mutation. JAMA 277, 793–799 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kosik, KS et al. Homozygotie der autosomal-dominanten Alzheimer-Präsenilin-1-E280A-Mutation. Neurologie 84, 206–208. https://doi.org/10.1212/WNL.0000000000001130 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Llibre-Guerra, JJ et al. Dominant vererbte Alzheimer-Krankheit in Lateinamerika: Genetische Heterogenität und klinische Phänotypen. Alzheimer-Demenz. 17, 653–664. https://doi.org/10.1002/alz.12227 (2021).

Artikel Google Scholar

Mendivil-Perez, M., Velez-Pardo, C., Kosik, KS, Lopera, F. & Jimenez-Del-Rio, M. Von iPSCs abgeleitete nervenähnliche Zellen der familiären Alzheimer-Krankheit PSEN 1 E280A zeigen erhöhtes Amyloid-Beta Konzentrationen und Verlust des Y-Chromosoms. Neurosci. Lette. 703, 111–118. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2019.03.032 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vallejo-Diez, S. et al. Erzeugung einer iPSC-Linie (IMEDEAi006-A) von einem Patienten mit früh einsetzender familiärer Alzheimer-Krankheit (fAD), der die E280A-Mutation im PSEN1-Gen trägt. Stem Cell Res 37, 101440. https://doi.org/10.1016/j.scr.2019.101440 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Frederiksen, HR, Holst, B., Mau-Holzmann, UA, Freude, K. & Schmid, B. Erzeugung von zwei isogenen iPSC-Linien mit entweder einer heterozygoten oder einer homozygoten E280A-Mutation im PSEN1-Gen. Stammzellres. 35, 101403. https://doi.org/10.1016/j.scr.2019.101403 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Velez-Pardo, C. et al. CA1-Hippocampus-Neuronenverlust bei familiärer Alzheimer-Krankheit: Die Presenilin-1-E280A-Mutation steht im Zusammenhang mit Epilepsie. Epilepsie 45, 751–756. https://doi.org/10.1111/j.0013-9580.2004.55403.x (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dinkel, F. et al. Verminderte Ablagerung von Beta-Amyloid 1–38 und erhöhte Ablagerung von Beta-Amyloid 1–42 im Hirngewebe von Patienten mit familiärer Alzheimer-Krankheit Presenilin-1 E280A. Vorderseite. Alternde Neurowissenschaften. https://doi.org/10.3389/fnagi.2020.00220 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Arango Lasprilla, JC, Iglesias, J. & Lopera, F. Neuropsychologischer Verlauf der familiären Alzheimer-Krankheit, verursacht durch die Mutation E280A im Presenilin-1-Gen. Bin. J. Alzheimers Dis. Andere Demen. 18, 137–146. https://doi.org/10.1177/153331750301800306 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

Vannini, P. et al. Verlauf der Unkenntnis des Gedächtnisverlusts bei Personen mit autosomal-dominant vererbter Alzheimer-Krankheit. JAMA Netw. Öffnen Sie 3, e2027472. https://doi.org/10.1001/jamanetworkopen.2020.27472 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Guzmán-Vélez, E. et al. Assoziatives Gedächtnis und In-vivo-Gehirnpathologie bei asymptomatischen Presenilin-1-E280A-Trägern. Neurology 95, e1312–e1321. https://doi.org/10.1212/WNL.0000000000010177 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fox-Fuller, JT et al. Kortikale Dicke über die Lebensspanne in einer kolumbianischen Kohorte mit autosomal-dominant vererbter Alzheimer-Krankheit: Eine Querschnittsstudie. Alzheimer-Demenz.: Diagn. Bewerten. Dis. Monitor. 13, e12233. https://doi.org/10.1002/dad2.12233 (2021).

Artikel Google Scholar

Bocanegra, Y. et al. Zusammenhang zwischen visuellem Gedächtnis und In-vivo-Amyloid- und Tau-Pathologie bei präklinischer autosomal-dominanter Alzheimer-Krankheit. J. Int. Neuropsychol. Soc. 27, 47–55. https://doi.org/10.1017/S1355617720000673 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Armstrong, GW et al. Netzhautbildgebungsbefunde bei Trägern mit PSEN1-assoziierter früh einsetzender familiärer Alzheimer-Krankheit vor dem Einsetzen kognitiver Symptome. JAMA Ophthalmol. 139, 49–56. https://doi.org/10.1001/jamaophthalmol.2020.4909 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Palmqvist, S. et al. Unterscheidungsgenauigkeit von Plasma-Phospho-tau217 für die Alzheimer-Krankheit im Vergleich zu anderen neurodegenerativen Erkrankungen. JAMA 324, 772–781. https://doi.org/10.1001/jama.2020.12134 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Quiroz, YT et al. Plasma-Neurofilament-Leichtkette im autosomal dominanten Präsenilin 1 E280A der Alzheimer-Krankheit: Eine Querschnitts- und Längsschnitt-Kohortenstudie. Lancet Neurol. 19, 513–521. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(20)30137-X (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sanchez, JS et al. Longitudinale Amyloid- und Tau-Akkumulation bei autosomal-dominant vererbter Alzheimer-Krankheit: Ergebnisse der Biomarker-Studie Colombia-Boston (COLBOS). Alzheimer Res. Dort. 13, 27. https://doi.org/10.1186/s13195-020-00765-5 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guzmán-Vélez, E. et al. Amyloid-β- und Tau-Pathologien stehen im Zusammenhang mit ausgeprägten Hirndyskonnektomien bei der präklinischen autosomal-dominanten Alzheimer-Krankheit. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 119, e2113641119. https://doi.org/10.1073/pnas.2113641119 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tariot, PN et al. Studie der Alzheimer Prevention Initiative zur autosomal-dominanten Alzheimer-Krankheit: Eine Studie zu Crenezumab im Vergleich zu Placebo bei präklinischen PSEN1-E280A-Mutationsträgern zur Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit bei der Behandlung der autosomal-dominanten Alzheimer-Krankheit, einschließlich einer mit Placebo behandelten Kohorte ohne Träger. Alzheimer-Demenz. 4, 150–160. https://doi.org/10.1016/j.trci.2018.02.002 (2018).

Artikel Google Scholar

Soto-Mercado, V., Mendivil-Perez, M., Velez-Pardo, C., Lopera, F. & Jimenez-Del-Rio, M. Cholinerge Neuronen, die die PSEN1 E280A-Mutation aus der familiären Alzheimer-Krankheit tragen, zeigen intraneuronale sAPPβ-Fragmente Akkumulation, Hyperphosphorylierung von TAU, oxidativer Stress, Apoptose und Ca2+-Dysregulation: Therapeutische Implikationen. PLoS One 15, e0221669. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0221669 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soto-Mercado, V., Mendivil-Perez, M., Velez-Pardo, C. & Jimenez-Del-Rio, M. Neuroprotektive Wirkung der kombinierten Behandlung mit Epigallocatechin-3-gallat und Melatonin auf die familiäre Alzheimer-Krankheit psen1 E280A abgeleitete zerebrale Sphäroide aus menstruellen mesenchymalen Stromazellen. J. Alzheimer Dis. 2023, 1–16. https://doi.org/10.3233/JAD-220903 (2023).

Artikel Google Scholar

Wolfe, MS Struktur und Funktion des γ-Sekretase-Komplexes. Biochemie 58, 2953–2966. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.9b00401 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou, R., Yang, G. & Shi, Y. Makromolekularer Komplex bei der Erkennung und Proteolyse des Amyloid-Vorläuferproteins bei der Alzheimer-Krankheit. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 61, 1–8. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2019.09.004 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bhattarai, A. et al. Mechanismus des Tripeptid-Trimmens des Amyloid-β-Peptids 49 durch γ-Sekretase. Marmelade. Chem. Soc. 144, 6215–6226. https://doi.org/10.1021/jacs.1c10533 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, R., Yang, G. & Shi, Y. Dominanter negativer Effekt der funktionslosen γ-Sekretase-Mutanten auf das Wildtyp-Enzym durch Heterooligomerisierung. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 114, 12731–12736. https://doi.org/10.1073/pnas.1713605114 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, L., Zhou, R., Yang, G. & Shi, Y. Analyse von 138 pathogenen Mutationen in Presenilin-1 auf die In-vitro-Produktion von Aβ42- und Aβ40-Peptiden durch γ-Sekretase. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 114, E476–E485. https://doi.org/10.1073/pnas.1618657114 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Acosta-Uribe, J. et al. Eine neurodegenerative Krankheitslandschaft mit seltenen Mutationen in Kolumbien aufgrund von Gründereffekten. Genommed. 14, 27. https://doi.org/10.1186/s13073-022-01035-9 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramirez Aguilar, L. et al. Genetischer Ursprung einer großen Familie mit einer neuartigen PSEN1-Mutation (Ile416Thr). Alzheimer-Demenz 15, 709–719. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2018.12.010 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Smith, JE: Die Demenz einer kolumbianischen Familie, eine Reise durch Rasse und Geschichte. Undark Magazine (https://undark.org/) (2019).

Fleisher, AS et al. Florbetapir-PET-Analyse der Amyloid-β-Ablagerung in der autosomal-dominanten Alzheimer-Krankheit Presenilin 1 E280A: eine Querschnittsstudie. Lancet Neurol. 11, 1057–1065. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(12)70227-2 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Quiroz, YT et al. Zusammenhang zwischen Amyloid- und Tau-Akkumulation bei jungen Erwachsenen mit autosomal-dominant vererbter Alzheimer-Krankheit. JAMA Neurol. 75, 548–556. https://doi.org/10.1001/jamaneurol.2017.4907 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Acosta-Baena, N. et al. Klinische Stadien vor der Demenz bei familiärer, früh einsetzender Alzheimer-Krankheit: Eine retrospektive Kohortenstudie. Lancet Neurol. 10, 213–220. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(10)70323-9 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Petit, D. et al. Aβ-Profile, die von PSEN1-Varianten erzeugt werden, die die Alzheimer-Krankheit verursachen, bestimmen die Pathogenität der Mutation und sagen das Alter bei Krankheitsausbruch voraus. Mol. Psychiatrie 27, 2821–2832. https://doi.org/10.1038/s41380-022-01518-6 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dominici, M. et al. Minimale Kriterien zur Definition multipotenter mesenchymaler Stromazellen. Stellungnahme der International Society for Cellular Therapy. Zytotherapie 8, 315–317. https://doi.org/10.1080/14653240600855905 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Viswanathan, S. et al. Mesenchymale Stammzellen versus Stromazellen: Stellungnahme des Ausschusses für mesenchymale Stromazellen der International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT®) zur Nomenklatur. Zytotherapie 21, 1019–1024. https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2019.08.002 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bozorgmehr, M. et al. Mesenchymale Stamm-/Stromazellen des Endometrium- und Menstruationsbluts: Biologische Eigenschaften und klinische Anwendung. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00497 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Quintero-Espinosa, D. et al. Latentes Tri-Lineage-Potenzial von aus menschlichem Menstruationsblut stammenden mesenchymalen Stromazellen, das durch spezifische In-vitro-Kulturbedingungen aufgedeckt wurde. Mol. Neurobiol. 58, 5194–5209. https://doi.org/10.1007/s12035-021-02442-6 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lancaster, MA & Knoblich, JA Erzeugung zerebraler Organoide aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Nat. Protokoll. 9, 2329–2340. https://doi.org/10.1038/nprot.2014.158 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pistollato, F., Canovas-Jorda, D., Zagoura, D. & Price, A. Protokoll zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in gemischte Kulturen aus Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/55702 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rios-Romenets, S. et al. Grundlegende demografische, klinische und kognitive Merkmale der kolumbianischen Studie der Alzheimer-Präventionsinitiative (API) zur autosomal-dominanten Alzheimer-Krankheit. Alzheimer-Demenz 16, 1023–1030. https://doi.org/10.1002/alz.12109 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Soto-Mercado, V., Mendivil-Perez, M., Velez-Pardo, C. & Jimenez-Del-Rio, M. (−)-Epigallocatechin-3-gallat verringert intra- und extrazelluläre Amyloid-induzierte zytotoxische Wirkungen auf cholinerge -ähnliche Neuronen der familiären Alzheimer-Krankheit PSEN1 E280A. Biomolecules 11, 1845. https://doi.org/10.3390/biom11121845 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bonilla-Porras, AR, Velez-Pardo, C. & Jimenez-Del-Rio, M. Schnelle Transdifferenzierung menschlicher mesenchymaler Wharton-Gelee-Stammzellen in Neurosphären und nervenähnliche Zellen. J. Neurosci. Methoden 282, 52–60. https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2017.03.005 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E. & Constantin, G. In-vitro-Modelle neurodegenerativer Erkrankungen. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 8, 328. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00328 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, NS, Karan, A., Lee, D., Yan, Z. & Xie, J. Fortschritte bei der Modellierung der Alzheimer-Krankheit in vitro. Adv. Nanobiomed. Res. 1, 2100097. https://doi.org/10.1002/anbr.202100097 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Hasan, MF & Trushina, E. Fortschritte bei der Rekapitulation von Phänotypen der Alzheimer-Krankheit unter Verwendung von In-vitro-Modellen auf der Basis menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen. Gehirnwissenschaft. 12, 552. https://doi.org/10.3390/brainsci12050552 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mendivil-Perez, M., Velez-Pardo, C. & Jimenez-Del-Rio, M. Direkte Transdifferenzierung menschlicher mesenchymaler Wharton-Gelee-Stromazellen in cholinerge ähnliche Neuronen. J. Neurosci. Methoden 312, 126–138. https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2018.11.019 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

LaFerla, FM, Green, KN & Oddo, S. Intrazelluläres Amyloid-β bei der Alzheimer-Krankheit. Nat. Rev. Neurosci. 8, 499–509. https://doi.org/10.1038/nrn2168 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Welikovitch, LA et al. Hinweise auf eine intraneuronale Aβ-Akkumulation vor der Tau-Pathologie im entorhinalen Kortex. Acta Neuropathol. 136, 901–917. https://doi.org/10.1007/s00401-018-1922-z (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kondo, T. et al. Die Modellierung der Alzheimer-Krankheit mit iPSCs zeigt Stressphänotypen, die mit intrazellulärem aβ und unterschiedlicher Arzneimittelreaktivität verbunden sind. Zellstammzelle 12, 487–496. https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.01.009 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kienlen-Campard, P., Miolet, S., Tasiaux, B. & Octave, J.-N. Intrazelluläres Amyloid-β1–42, jedoch keine extrazellulären löslichen Amyloid-β-Peptide, induziert neuronale Apoptose. J. Biol. Chem. 277, 15666–15670. https://doi.org/10.1074/jbc.M200887200 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Capetillo-Zarate, E., Gracia, L., Tampellini, D. & Gouras, GK Intraneuronale Aβ-Akkumulation, Amyloidplaques und Synapsenpathologie bei der Alzheimer-Krankheit. Neurodegener. Dis. 10, 56–59. https://doi.org/10.1159/000334762 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brewer, GJ et al. Altersbedingte intraneuronale Aggregation von Amyloid-β in Endosomen, Mitochondrien, Autophagosomen und Lysosomen. J. Alzheimer Dis. 73, 229–246. https://doi.org/10.3233/JAD-190835 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Dunys, J., Valverde, A. & Checler, F. Sind N- und C-terminal verkürzte Aβ-Spezies wichtige pathologische Auslöser bei der Alzheimer-Krankheit? J. Biol. Chem. 293, 15419–15428. https://doi.org/10.1074/jbc.R118.003999 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rostagno, A., Cabrera, E., Lashley, T. & Ghiso, J. N-terminal verkürzte Aβ4-x-Proteoformen und ihre Relevanz für die Pathophysiologie der Alzheimer-Krankheit. Übers. Neurodegener. 11, 30. https://doi.org/10.1186/s40035-022-00303-3 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takahashi, RH, Nagao, T. & Gouras, GK Plaquebildung und die intraneuronale Akkumulation von β-Amyloid bei der Alzheimer-Krankheit. Pathol. Int. 67, 185–193. https://doi.org/10.1111/pin.12520 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cheng, N., Cai, H. & Belluscio, L. Das In-vivo-Geruchsmodell der APP-induzierten Neurodegeneration zeigt eine reversible zellautonome Funktion. J. Neurosci. 31, 13699–13704. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1714-11.2011 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng, N., Jiao, S., Gumaste, A., Bai, L. & Belluscio, L. APP-Überexpression führt über den intrinsischen Apoptoseweg zum aβ-unabhängigen neuronalen Tod. eNeuro 3, JAN.0150-16.2016. https://doi.org/10.1523/JAN.0150-16.2016 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Norstrom, E. Stoffwechselverarbeitung des Amyloid-Vorläuferproteins – Neue Teile des Alzheimer-Puzzles. Entdeckung. Med. 23, 269–276 (2017).

PubMed Google Scholar

Wolfe, MS & Yankner, BA Aussortieren von Presenilinen bei der Alzheimer-Krankheit. Zelle 166, 13–15. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.06.034 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fukumori, A., Feilen, LP & Steiner, H. Substratrekrutierung durch γ-Sekretase. Semin. Zellentwickler. Biol. 105, 54–63. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2020.03.006 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pimenova, AA & Goate, AM Neuartige Presenilin-1- und 2-Doppel-Knockout-Zelllinie zur In-vitro-Validierung von PSEN1- und PSEN2-Mutationen. Neurobiol. Dis. 138, 104785. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2020.104785 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heilig, EA, Gutti, U., Tai, T., Shen, J. & Kelleher, RJ Transdominante negative Auswirkungen pathogener PSEN1-Mutationen auf die Sekretaseaktivität und -produktion. J. Neurosci. 33, 11606–11617. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0954-13.2013 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sannerud, R. et al. Die eingeschränkte Lokalisierung von PSEN2/γ-Sekretase bestimmt die Substratspezifität und erzeugt einen intrazellulären Aβ-Pool. Zelle 166, 193–208. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.020 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wirths, O., Multhaup, G. & Bayer, TA Eine modifizierte Beta-Amyloid-Hypothese: intraneuronale Akkumulation des Beta-Amyloid-Peptids – der erste Schritt einer tödlichen Kaskade. J. Neurochem. 91, 513–520. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2004.02737.x (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kaminsky, YG, Tikhonova, LA & Kosenko, EA Kritische Analyse der Toxizität von Alzheimer-Amyloid-Beta-NBSP gegenüber Mitochondrien. Vorderseite. Biowissenschaften. 20, 173–197. https://doi.org/10.2741/4304 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Kinumi, T., Kimata, J., Taira, T., Ariga, H. & Niki, E. Cystein-106 von DJ-1 ist der empfindlichste Cysteinrest gegenüber Wasserstoffperoxid-vermittelter Oxidation in vivo im Endothel der menschlichen Nabelschnurvene Zellen. Biochem. Biophys. Res. Komm. 317, 722–728. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.03.110 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marinho, HS, Real, C., Cyrne, L., Soares, H. & Antunes, F. Wasserstoffperoxid-Erkennung, Signalisierung und Regulierung von Transkriptionsfaktoren. Redox-Biol. 2, 535–562. https://doi.org/10.1016/j.redox.2014.02.006 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Di Marzo, N., Chisci, E. & Giovannoni, R. Die Rolle von Wasserstoffperoxid bei der redoxabhängigen Signalübertragung: Homöostatische und pathologische Reaktionen in Säugetierzellen. Zellen 7, 156. https://doi.org/10.3390/cells7100156 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rhee, SG Redox-Signalisierung: Wasserstoffperoxid als intrazellulärer Botenstoff. Exp. Mol. Med. 31, 53–59. https://doi.org/10.1038/emm.1999.9 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cha, M.-Y. et al. Die mitochondrienspezifische Anreicherung von Amyloid β induziert eine mitochondriale Dysfunktion, die zum apoptotischen Zelltod führt. PLoS One 7, e34929. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0034929 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bossy-Wetzel, E., Bakiri, L. & Yaniv, M. Induktion von Apoptose durch Transkriptionsfaktor c-Jun. EDUCATION J. 16, 1695–1709. https://doi.org/10.1093/embodiment/16.7.1695 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aubrey, BJ, Kelly, GL, Janic, A., Herold, MJ & Strasser, A. Wie induziert p53 Apoptose und wie hängt dies mit der p53-vermittelten Tumorsuppression zusammen? Zelltod ist unterschiedlich. 25, 104–113. https://doi.org/10.1038/cdd.2017.169 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lu, H., Hou, G., Zhang, Y., Dai, Y. & Zhao, H. c-Jun transaktiviert die Puma-Genexpression, um Arthrose zu fördern. Mol. Med. Rep. 9, 1606–1612. https://doi.org/10.3892/mmr.2014.1981 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yu, J., Zhang, L., Hwang, PM, Kinzler, KW & Vogelstein, B. PUMA induziert die schnelle Apoptose von Darmkrebszellen. Mol. Zelle 7, 673–682. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(01)00213-1 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakano, K. & Vousden, KH PUMA, ein neuartiges proapoptotisches Gen, wird durch p53 induziert. Mol. Zelle 7, 683–694. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(01)00214-3 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, M. Die Rolle des P53-hochregulierten Modulators der Apoptose (PUMA) bei der Entwicklung der Eierstöcke sowie bei kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen. Apoptose 26, 235–247. https://doi.org/10.1007/s10495-021-01667-z (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Obulesu, M. & Lakshmi, MJ Apoptose bei der Alzheimer-Krankheit: Ein Verständnis der Physiologie. Pathol. Dort. Alleen. Neurochem Res 39, 2301–2312. https://doi.org/10.1007/s11064-014-1454-4 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Yang, J. et al. Frühes pathogenes Ereignis der Alzheimer-Krankheit, dokumentiert in iPSCs von Patienten mit PSEN1-Mutationen. Oncotarget 8, 7900–7913. https://doi.org/10.18632/oncotarget.13776 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Gallego Villarejo, L. et al. Rolle von intrazellulärem Amyloid β als Signalwegmodulator, Biomarker und Therapieziel. Int. J. Mol. Wissenschaft. 23, 4656. https://doi.org/10.3390/ijms23094656 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, L. et al. Intrazelluläre Amyloidtoxizität induziert den durch Oxytose/Ferroptose regulierten Zelltod. Zelltod-Dis. 11, 828. https://doi.org/10.1038/s41419-020-03020-9 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, J.-H. et al. Eine fehlerhafte Ansäuerung der Autolysosomen in Mäusemodellen mit Alzheimer-Krankheit induziert die autophagische Ansammlung von Aβ in Neuronen, was zu senilen Plaques führt. Nat. Neurosci. 25, 688–701. https://doi.org/10.1038/s41593-022-01084-8 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okazawa, H. Intrazelluläre Amyloid-Hypothese für die Pathologie der Alzheimer-Krankheit in der Ultrafrühphase. Neuropathologie 41, 93–98. https://doi.org/10.1111/neup.12738 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neddens, J. et al. Phosphorylierung verschiedener Tau-Stellen während des Fortschreitens der Alzheimer-Krankheit. Acta Neuropathol. Komm. 6, 52. https://doi.org/10.1186/s40478-018-0557-6 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alafuzoff, I. et al. Stadieneinteilung der neurofibrillären Pathologie bei der Alzheimer-Krankheit: Eine Studie des Brainnet Europe-Konsortiums. Gehirnpathol. 18, 484–496. https://doi.org/10.1111/j.1750-3639.2008.00147.x (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Neddens, J. et al. Korrelation der Pyroglutamat-Amyloid-β- und Ptau-Ser202/Thr205-Spiegel bei der Alzheimer-Krankheit und verwandten Mausmodellen. PLoS One 15, e0235543. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235543 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stancu, I.-C., Vasconcelos, B., Terwel, D. & Dewachter, I. Modelle der β-Amyloid-induzierten Tau-Pathologie: Der lange und „gefaltete“ Weg zum Verständnis des Mechanismus. Mol. Neurodegener. 9, 51. https://doi.org/10.1186/1750-1326-9-51 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gomes, LA et al. Aβ-induzierte Beschleunigung der Ausbreitung der Alzheimer-bedingten τ-Pathologie und deren Assoziation mit Prionprotein. Acta Neuropathol. 138, 913–941. https://doi.org/10.1007/s00401-019-02053-5 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ma, Q.-L. et al. Amyloid-Oligomere induzieren die Phosphorylierung von Tau und die Inaktivierung des Insulinrezeptorsubstrats über die Signalübertragung der N-terminalen Kinase c-Jun: Unterdrückung durch Omega-3-Fettsäuren und Curcumin. J. Neurosci. 29, 9078–9089. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1071-09.2009 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qin, P. et al. Jüngste Fortschritte bei niedermolekularen JNK3-Inhibitoren für die Alzheimer-Krankheit. Bioorg. Chem. 128, 106090. https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2022.106090 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawamoto, EM, Vivar, C. & Camandola, S. Physiologie und Pathologie der Kalziumsignalisierung im Gehirn. Vorderseite. Pharmakol. https://doi.org/10.3389/fphar.2012.00061 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tong, BC-K., Wu, AJ, Li, M. & Cheung, K.-H. Kalziumsignalisierung bei der Alzheimer-Krankheit und Therapien. Biochim. Biophys. Acta BBA Mol. Zellauflösung 1865, 1745–1760. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2018.07.018 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Sawamura, N., Ju, Y. & Asahi, T. Cholinerger Rezeptor, Nikotin, Alpha 7 als Zielmolekül des arktischen mutierten Amyloid β. Neuronal. Regen. Res. 13, 1360–1361. https://doi.org/10.4103/1673-5374.235238 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dani, JA & Bertrand, D. Nikotinische Acetylcholinrezeptoren und nikotinische cholinerge Mechanismen des Zentralnervensystems. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 699–729. https://doi.org/10.1146/annurev.pharmtox.47.120505.105214 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yiannopoulou, KG, Anastasiou, AI, Zachariou, V. & Pelidou, S.-H. Gründe für gescheiterte Studien zu krankheitsmodifizierenden Behandlungen der Alzheimer-Krankheit und ihr Beitrag in der aktuellen Forschung. Biomedicines 7, 97. https://doi.org/10.3390/biomedicines7040097 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Imbimbo, BP, Lucca, U. & Watling, M. Können monoklonale Anti-Β-Amyloid-Antikörper bei der autosomal-dominanten Alzheimer-Krankheit wirken? Neurol. Genet. 7, e535. https://doi.org/10.1212/NXG.0000000000000535 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, Y. et al. Biologische Eigenschaften von aus menschlichem Menstruationsblut gewonnenen Endometriumstammzellen. J. Cell Mol. Med. 22, 1627–1639. https://doi.org/10.1111/jcmm.13437 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, S. et al. Unterschiedliche Eigenschaften mesenchymaler Nabelschnurstammzellen von Spendern unterschiedlichen Alters. Zellgewebebank 14, 707–713. https://doi.org/10.1007/s10561-013-9364-2 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Xie, X. et al. Konstruktion eines manipulierten Corpus Cavernosum mit primären mesenchymalen Stammzellen in vitro. Wissenschaft. Rep. 7, 18053. https://doi.org/10.1038/s41598-017-18129-9 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jensen, EC Quantitative Analyse histologischer Färbung und Fluoreszenz mit imageJ. Anat. Empf. 296, 378–381. https://doi.org/10.1002/ar.22641 (2013).

Artikel Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: Eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9, 676–682. https://doi.org/10.1038/nmeth.2019 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Siddiqui, MA et al. Rotenon-induzierter oxidativer Stress und Apoptose in menschlichen Leber-HepG2-Zellen. Mol. Zellbiochem. 384, 59–69. https://doi.org/10.1007/s11010-013-1781-9 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lichtman, JW & Conchello, J.-A. Fluoreszenzmikroskopie. Nat. Methoden 2, 910–919. https://doi.org/10.1038/nmeth817 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y. & Nalbant, A. Durchflusszytometrie: Grundprinzipien und Anwendungen. Krit. Rev. Biotechnol. 37, 163–176. https://doi.org/10.3109/07388551.2015.1128876 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Arcila, ML et al. Die Aktivierung der Apoptose, aber nicht der Nekrose, während einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion korrelierte mit einem verminderten Bakterienwachstum: Rolle von TNF-α, IL-10, Caspasen und Phospholipase A2. Zellimmunol. 249, 80–93. https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2007.11.006 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Armijo, E. et al. Erhöhte Anfälligkeit für Aβ-Toxizität in neuronalen Kulturen, die aus durch familiäre Alzheimer-Krankheit (PSEN1-A246E) induzierten pluripotenten Stammzellen stammen. Neurosci. Lette. 639, 74–81. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2016.12.060 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pap, P., Kőszeghy, Á., Szűcs, G. & Rusznák, Z. Zytoplasmatische Ca2+-Konzentrationsänderungen, hervorgerufen durch cholinerge Stimulation in primären Astrozytenkulturen, die aus dem Cochleakern der Ratte hergestellt wurden. Hören. Res. 255, 73–83. https://doi.org/10.1016/j.heares.2009.05.006 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lazic, SE, Clarke-Williams, CJ & Munafò, MR Was genau ist „N“ in Zellkulturen und Tierversuchen? PLoS Biol. 16, e2005282. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005282 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Antioquia Neuroscience Group, Medizinisches Forschungsinstitut, Medizinische Fakultät, Universität Antioquia (UdeA), Calle 70 Nr. 52-21 und Calle 62 Nr. 52-59, Torre 1, Laboratorio 412, Medellín, Kolumbien

Nicolas Gomez-Sequeda, Miguel Mendivil-Perez, Marlene Jimenez-Del-Rio, Francisco Lopera und Carlos Velez-Pardo

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Konzeptualisierung MJ-Del-R., CV-P.; Methodik NG-S., MM-P., CV-P.; Validierung NG-S., MM-P.; Formale Analyse NG-S., MM-P.; Untersuchung NG-S., MM-P., FL; Datenkuration NG-S., MM-P.; Aufsicht MJ-Del-R.; Projektadministration CV-P.; Ressourcen FL, CV-P., MJ-Del-R.; Finanzierungseinwerbung MJ-Del-R., CV-P.; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung MJ-Del-R., CV-P.; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten von NG-S., MM-P., MJ-Del-R., FL, CV-P.

Korrespondenz mit Carlos Vélez-Pardo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gomez-Sequeda, N., Mendivil-Perez, M., Jimenez-Del-Rio, M. et al. Cholinerge-ähnliche Neuronen und zerebrale Sphäroide, die die Variante PSEN1 p.Ile416Thr tragen, spiegeln die Neuropathologie der Alzheimer-Krankheit wider. Sci Rep 13, 12833 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39630-4

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Eingegangen: 18. November 2022

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39630-4

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